SAOG對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

宋麗麗，宋鑫迪，張曉玲，王 瑤，孫可歆，李正祎

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院，吉林 吉林 132013)

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)是一種細(xì)胞毒性藥物，能通過殺傷免疫細(xì)胞影響免疫的各個階段，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，廣泛應(yīng)用于制備免疫抑制動物模型[1-2]。本試驗采用CTX制備免疫低下小鼠模型，使用北五味子、黃芪、麥冬復(fù)合多糖和人參皂苷(SAOG)對其進(jìn)行治療。通過檢測特異性和非特異性免疫功能相關(guān)指標(biāo)，觀察SAOG對CTX致小鼠免疫低下的保護(hù)作用及增強(qiáng)免疫功能，探討其增強(qiáng)免疫的作用，為其進(jìn)一步應(yīng)用和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 北五味子，購自吉林省集安市五味子種植基地；黃芪、麥冬和人參，均購自安圖市安興中藥飲片有限公司；北五味子多糖、黃芪多糖、麥冬多糖、人參皂苷，均由北華大學(xué)藥理教研室協(xié)助提取。IL-1β試劑盒，購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司；豚鼠血清，購自玉環(huán)縣南方試劑廠；10%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)，購自北京Bersee科技有限公司；CTX，購自江蘇盛迪藥業(yè)有限公司；CD4-PE、CD8-PC5、CD3-FITC流式抗體，均購自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗儀器 Infinite M200酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；UV2550分光光度計，日本島津光譜儀公司；Epics-XL流式細(xì)胞儀，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司。

1.3 實(shí)驗動物 SPF級6～8周齡，雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由長春億斯實(shí)驗動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉) 2016-0003，于北華大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗室飼養(yǎng)，室溫 20～25 ℃，相對濕度40%～60%。

1.4 試驗方法

1.4.1 分組、模型制備與給藥 將雄性ICR小鼠隨機(jī)分為5組，設(shè)對照(正常)組(Contral group,CON)，免疫抑制模型組(Model group,MOD)，SAOG低、中、高劑量組(SAOG-Low,Medium,High dose group,SAOG-L,M,H)，劑量分別為0.4、0.8、1.6 mg/(10 g·bw)，每組各10只動物。SAOG溶液的制備見參考文獻(xiàn)[3]。各組均按10 mL/(kg·bw)進(jìn)行灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)21 d；對照組及免疫抑制模型組給予等體積生理鹽水灌胃。除對照組外，其他各組在給予不同劑量SAOG溶液灌胃第17天開始，連續(xù)5 d腹腔注射CTX 20 mg/(kg·bw·d)，末次注射24 h后，采血并剖檢測定各項指標(biāo)。

1.4.2 SAOG對小鼠肝臟的影響 稱量各組小鼠體質(zhì)量，脫頸椎處死小鼠。取其肝臟，剪去脂肪和筋膜組織稱量肝臟質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。隨后剪取0.5 cm3的肝臟組織塊于10%福爾馬林溶液中固定，按5 μm厚度制備石蠟切片后蘇木精-伊紅(H.E.)染色，中性樹膠封片，顯微鏡下(放大200倍)觀察病理變化。

1.4.3 外周血液淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞分群 每管加入CD4-PE、CD8-PC5、CD3-FITC(2∶3∶3混合)混合抗體8 μL，全血50 μL；室溫條件下避光孵育30 min；裂解紅細(xì)胞，清洗2次；加細(xì)胞固定液100 μL /管后進(jìn)行流式分析。

1.4.4 測量血清溶血素 在灌胃后第17天，通過給免疫小鼠腹膜內(nèi)注射0.2 mL 5% SRBC，5 d后將小鼠麻醉摘除眼球后采血。將血液靜止10 min后，以1 500 r/min離心10 min以獲得血清，用生理鹽水稀釋100倍；分別將0.5 mL稀釋的血清(對照組中加0.5 mL生理鹽水)與0.5 mL 5% SRBC懸浮液，0.5 mL 10%補(bǔ)體(豚鼠血清)溶液和0.5 mL生理鹽水混合，然后在37 ℃放置30 min后立即放入冰水浴中停止反應(yīng)。將該混合物以1 500 r/min離心10 min以獲得上清液，在540 nm波長處測定吸光值A(chǔ)，以生理鹽水作空白調(diào)零。血清溶血素含量(HC50)根據(jù)下式計算：

HC50=樣品吸光度/SRBC 半數(shù)溶血時的吸光度×稀釋倍數(shù)

1.4.5 血清IL-1β水平檢測 將小鼠摘除眼球取血后，離心取上清液。采用ELISA 法檢測各組小鼠血清IL-1β水平，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。采用全波長酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處A450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IL-1β含量。

2 結(jié)果

2.1 SAOG對小鼠臟器指數(shù)的影響 結(jié)果如表1。由表1可知，腹腔注射CTX之后，與對照組相比免疫抑制模型組小鼠的體重出現(xiàn)很大程度的降低，表明建模成功。與對照組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；SAOG-H組肝臟指數(shù)與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明CTX對肝臟有損傷作用，可能是由于CTX主要代謝產(chǎn)物丙烯醛對肝臟產(chǎn)生的毒性作用，而SAOG能夠明顯減輕肝臟損傷程度，但SAOG-L/M組從外觀肝臟顏色及肝臟指數(shù)結(jié)果上看，雖與對照組無明顯差異，但略有好轉(zhuǎn)。

表1 SAOG對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of SAOG visceral index of mice

2.2 SAOG 對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響 結(jié)果見圖1，模型組小鼠血清溶血素水平較正常組降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示 CTX 有顯著抑制小鼠血清溶血素水平的作用，CTX致小鼠免疫低下模型構(gòu)建成功。SAOG-M/H組小鼠血清溶血素水平與模型組相比均顯著升高(P<0.05)，表明SAOG能有效提高CTX致免疫低下小鼠血清中溶血素含量，SAOG-L組SAOG小鼠血清溶血素水平與模型組相比雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但略有提高。

圖1 小鼠血清溶血素的測定Fig.1 Detection of serum hemolysin in mice注：與模型組比較，*：P<0.05；與對照組比較，#：P<0.05Note:Compare to model group,*:P<0.05.Compare to control group,#:P<0.05

2.3 SAOG對CTX 致免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞分化成熟的影響 不同劑量組的SAOG對CTX 致免疫低下小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例的影響如表2所示，結(jié)果表明：與模型組相比，SAOG-L/M/H劑量組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞的百分比及CD4+/CD8+T細(xì)胞的比例均上調(diào)，且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，但對CD8+T細(xì)胞的影響劑量反應(yīng)關(guān)系不明顯。與模型組相比，SAOG-L/M/H各劑量組均對CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及CD4+/CD8+T細(xì)胞影響，組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。

表2 SAOG對小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)及比例的影響Table 2 Effects of SAOG on the percentage of T cell subsets in mice peripheral blood

2.4 SAOG對CTX致免疫低下小鼠血清中細(xì)胞因子的影響 如圖2所示，與對照組相比模型組IL-1β明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，SAOG-M/H組IL-1β濃度明顯增高(P<0.05)。

圖2 血清IL-1β濃度檢測Fig.2 Detection of serum IL-1β concentration注：與模型組比較，*：P<0.05；與對照組比較，#：P<0.05Note:Compare to group model,*:P<0.05.Compare to group control,#:P<0.05

2.5 SAOG對CTX致免疫低下小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響 肝臟組織石蠟切片結(jié)果顯示(見封三彩版圖3)，對照組小鼠肝臟高倍鏡下顯示，肝索排列整齊，小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞形態(tài)良好排列整齊，雙核肝細(xì)胞較多胞核近圓形，中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，未見肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞病變；模型組小鼠，肝小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞胞漿疏松淡然，肝血竇變窄或消失，肝細(xì)胞水腫較明顯；SAOG各劑量組肝臟組織高倍鏡下顯示與正常對照組未見明顯差異。

圖3 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢測 (H.E.染色，200×)Fig.3 Mice liver tissues detected by histopathology (H.E.staining,200×)A：對照組；B：模型組；C：SAOG低劑量組；D：SAOG中劑量組；E：SAOG高劑量組A:Control group;B:Model group;C:SAOG-Low dose group;D:SAOG-Middle dose group;E:SAOG-High dose group

3 討論

中國擁有數(shù)千年研究中藥的歷史，在古代一直用中藥治療各種疾病，中藥種類繁多，其中很多都具有免疫調(diào)節(jié)作用。如中藥中含有的多糖為常見的免疫調(diào)節(jié)性物質(zhì)，對機(jī)體細(xì)胞/體液免疫及非特異性免疫均有廣泛的影響。中藥中含有的苷類化合物也是常見的可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用的免疫調(diào)節(jié)性物質(zhì)。本試驗所用復(fù)方中藥主要用于調(diào)節(jié)免疫功能，由北五味子、黃芪、麥冬、人參(Schisandra,Astragalus,Radix ophiopogonis,Ginseng,SAOG) 按原藥1∶5∶2∶1組成[3]。北五味子、黃芪、麥冬提取多糖，人參提取皂苷。五味子是著名的滋補(bǔ)性中藥，多糖含量豐富，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。黃芪有“補(bǔ)氣升陽之王”的美譽(yù)，其多糖成分是一種免疫調(diào)節(jié)劑，長期試驗證明其無毒副作用。大量研究表明,黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)和增強(qiáng)作用，且涉及到特異性和非特異性免疫等諸多方面[5-6]。麥冬多糖為麥冬發(fā)揮增強(qiáng)免疫作用的有效部位，除藥用外，麥冬作為保健飲品和功能性食品也受到了國際保健食品界的青睞[7]。人參皂苷具有提高機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫功能[8]。

本試驗在提取北五味子、黃芪、麥冬多糖、人參皂苷的基礎(chǔ)上，通過腹腔注射CTX建立免疫抑制模型，經(jīng)多項免疫指標(biāo)研究SAOG對小鼠免疫抑制的調(diào)節(jié)效應(yīng)。通過測定血清溶血素水平，用以檢測藥物對機(jī)體防御能力的影響。本試驗結(jié)果表明,SAOG能顯著提高免疫抑制小鼠血清溶血素水平，對免疫反應(yīng)起正調(diào)節(jié)作用。同時試驗結(jié)果還表明，SAOG 能顯著提高免疫抑制小鼠外周血免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1β，對免疫反應(yīng)起正調(diào)節(jié)作用。根據(jù)試驗結(jié)果SAOG正向調(diào)節(jié)小鼠機(jī)體免疫功能，可能源自其對T淋巴細(xì)胞分化成熟的調(diào)節(jié)作用。該作用不僅提升了小鼠細(xì)胞免疫水平，還促進(jìn)了免疫細(xì)胞分泌各種淋巴因子。

CD4+/CD8+T細(xì)胞常作為免疫調(diào)節(jié)的一項指標(biāo)，免疫力低下者常存在T細(xì)胞亞群比例異常現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為CD3+T、CD4+T細(xì)胞總數(shù)減少，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值下降，因此可通過檢測外周血淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+T細(xì)胞比例作為判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)的一項指標(biāo)。若CD4+/CD8+T細(xì)胞比例上升，則提示正向免疫調(diào)節(jié)占優(yōu)勢，反之則為負(fù)向免疫調(diào)節(jié)占優(yōu)勢。本試驗結(jié)果顯示，SAOG可以正向調(diào)節(jié)小鼠的機(jī)體免疫功能。

細(xì)胞因子是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是由活化的免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的多肽分子或糖蛋白，具有高活性，可執(zhí)行多種生理功能，同時也是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝的主要介質(zhì)。細(xì)胞因子的含量代表著免疫系統(tǒng)的自身代謝狀態(tài)。本試驗結(jié)果顯示，SAOG-M/H組小鼠細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)水平明顯升高進(jìn)而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

肝臟是機(jī)體固有免疫功能的主要執(zhí)行者，調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的平衡關(guān)系，是機(jī)體防御侵害的重要天然屏障。CTX對肝臟的毒性作用較大[9-10]，本試驗中，CTX模型組小鼠肝臟腫大呈黃紅色，膽囊萎縮，肝細(xì)胞有壞死、凋亡現(xiàn)象。SAOG各給藥組能明顯緩解CTX引起的肝損傷癥狀，但各組之間病理切片鏡下無明顯差異。推測原因為小鼠肝臟再生能力較強(qiáng)，同時SAOG具有一定的減輕細(xì)胞炎性浸潤，減輕肝細(xì)胞水腫，促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用。已有研究表明，CTX造成的肝臟損傷在不同物種間的差異性小，不同來源的多糖對這種損傷都有明顯的緩解能力[11-12]。

導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂的原因較多。與西藥調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能相比，中藥較多為天然藥物，具有不良反應(yīng)小，副作用弱，價格便宜，物產(chǎn)豐富，藥效穩(wěn)定持久等優(yōu)點(diǎn)。中藥具有免疫調(diào)節(jié)作用的主要成分包括多糖、苷類化合物、生物堿、揮發(fā)油、有機(jī)酸等[13]。SAOG充分發(fā)揮了北五味子、黃芪、麥冬、人參的最有效免疫調(diào)節(jié)活性成分，以中醫(yī)基礎(chǔ)理論知識為指導(dǎo)，調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，糾正免疫功能紊亂。中醫(yī)理論認(rèn)為，化療藥物屬于外來毒邪，作用于機(jī)體可損傷正氣，致使正氣虛損。因此，化療后免疫抑制當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“虛勞”“虛損”范疇。SAOG采用扶正培本法[14]，扶助正氣，培植本元，從而調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽氣血、臟腑經(jīng)絡(luò)的生理功能，提高機(jī)體抗病能力，增強(qiáng)免疫功能。

綜上所述，SAOG能顯著增強(qiáng)小鼠免疫功能，為有開發(fā)前景的、有效的能增強(qiáng)免疫功能的組合方。