石家莊地區(qū)肉雞源金黃色葡萄球菌鑒定、毒力基因檢測及耐藥性分析

閆 港，宋立國，曹麗輝，張軍恒，胡永青

(1.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，河北 承德 067000；2.石家莊農(nóng)業(yè)學(xué)校，河北 石家莊 050000；3.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066604；4.河北省唐山市第六十二中學(xué)，河北 唐山 063000；5.河北省農(nóng)業(yè)對(duì)外貿(mào)易促進(jìn)中心，河北 石家莊 050011)

雞葡萄球菌病是一種急性敗血性或慢性傳染性疾病，臨床癥狀為急性敗血癥、關(guān)節(jié)炎、皮膚壞死和骨膜炎等，雛雞對(duì)該病最易感，發(fā)病率和死亡率均較高，成年雞感染后多呈慢性病程，且無明顯的季節(jié)性，是養(yǎng)雞生產(chǎn)中危害較嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一[1-3]。金黃色葡萄球菌(Straphylococcusaureus,S.aureus)對(duì)雞、鴨、牛、羊等多種動(dòng)物的致病力強(qiáng)弱與其本身所產(chǎn)生的毒素及相關(guān)的侵襲性酶具有相關(guān)性[4]。相關(guān)研究表明，金黃色葡萄球菌基因組中編碼腸毒素、中毒休克綜合征毒素和粘附因子等多種毒力基因，所攜帶毒力因子在金黃色葡萄球菌致病性中起著重要作用[5]。隨著蛋雞、肉雞養(yǎng)殖數(shù)量的增加，關(guān)于雞葡萄球菌報(bào)道逐漸增多，雞葡萄球菌的耐藥菌株呈現(xiàn)逐年上升趨勢，呈現(xiàn)多重耐藥性，在養(yǎng)殖過程中應(yīng)該引起重視。

2016—2018年采集石家莊地區(qū)患病肉雞的病料128份，分離得到57株金黃色葡萄球菌，對(duì)分離的57株金黃色葡萄球進(jìn)行致病性、毒力基因、耐藥性檢測。為該地區(qū)的肉雞葡萄球菌病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2017—2018年采集自石家莊地區(qū)患病肉雞的病料128份。

1.2 主要試劑與儀器 7%綿羊血培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試條，購自法國梅里埃公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。ATB自動(dòng)化微生物生化鑒定系統(tǒng)由法國生物梅里埃股份有限公司生產(chǎn)；梯度PCR儀由上海賽默生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；震蕩培養(yǎng)箱、隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康14日齡肉雛雞290只，由某市規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖場提供。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 將無菌采集病死肉雞的病料組織加入到增菌液中培養(yǎng)后，接種于7%綿羊血培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取單個(gè)優(yōu)勢菌落接種于甘露醇氯化鈉鑒別培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h。挑取單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)，取純化培養(yǎng)的分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生化試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌生化特性 按照Raid ID 32 STREP 陽性菌鑒定試條說明書，將純化培養(yǎng)的分離菌用ATB自動(dòng)化微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化特性鑒定。

1.6 細(xì)菌的PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[6]，設(shè)計(jì)金黃色葡萄球菌特異鑒定引物femB：5′-TCTTCAGTTCCAGTGTG-3′，5′-GTGGGGGTGAGTAA-3′，基因片段為651 bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將分離菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比。

1.7 細(xì)菌致病性 將純化的分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL。每株分離菌株腹腔注射5只試驗(yàn)肉雞，劑量為0.2 mL(1.0×106CFU/mL)，對(duì)照組(5只)腹腔注射等量的無菌生理鹽水，注射細(xì)菌12 h后，觀察6 d，記錄其死亡情況，進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.8 細(xì)菌的毒力基因檢測 參考文獻(xiàn)[7-8]設(shè)計(jì)金黃色葡萄球菌毒力基因14種(見表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用已提取的分離菌株的基因組DNA為模板，用PCR對(duì)分離菌株進(jìn)行毒力基因檢測，其PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

表1 金黃色葡萄球菌毒力基因引物序列Table 1 Primer sequences of virulence genes of S.aureus

1.9 細(xì)菌耐藥性檢測 分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2017年推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷，統(tǒng)計(jì)其耐藥數(shù)據(jù)，分析其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定 細(xì)菌分離與鑒定試驗(yàn)結(jié)果顯示，57株分離菌株的培養(yǎng)特性與形態(tài)學(xué)與報(bào)道的金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)特性與形態(tài)學(xué)觀察基本一致。

2.2 細(xì)菌生化特性 生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離到的57株分離菌株為金黃色葡萄球菌，合格率為99.5%～100%，與報(bào)道的金黃色葡萄球菌生化特性基本一致。

2.3 細(xì)菌的PCR鑒定 57株分離菌株均用金黃色葡萄球菌特異鑒定引物femB擴(kuò)增出大約為651 bp的目的基因條帶(見圖1)。57株分離菌株的PCR產(chǎn)物序列與GenBank中登錄的15株金黃色葡萄球菌參考株femB基因序列同源性為97.9%～99.9%，57株 分離菌株均為金黃色葡萄球菌。

圖1 部分金黃色葡萄球菌分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of some S.aureus isolatesM:Marker;1～6:分離菌株;7:空白對(duì)照M:Marker;1～6:Isolated strains;7:Blank control

2.4 細(xì)菌致病性 攻毒組的試驗(yàn)肉雞在攻毒后2～3 d，出現(xiàn)精神沉郁、縮頭垂翅、閉目、采食量減少，出現(xiàn)死亡，個(gè)別肉雞不表現(xiàn)任何癥狀出現(xiàn)急性死亡，從死亡試驗(yàn)肉雞的體內(nèi)分離到金黃色葡萄球菌，直到試驗(yàn)結(jié)束對(duì)照組試驗(yàn)雛雞未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，健康存活。通過統(tǒng)計(jì)分離的57株菌株中42株均能致雛雞死亡，說明42株分離菌株為致病性金黃色葡萄球菌。

2.5 細(xì)菌毒力基因檢測 用PCR方法對(duì)分離的42株致病性金黃色葡萄球菌攜帶的12種毒力基因進(jìn)行檢測，如表2所示，其中9種毒力基因被檢出，檢出率為75%(9/12)；毒力基因hla、hlb、sea、seb、sec、nuc檢出率較高，在54.8%～100%；毒力基因clfA、eta、etb檢出率在21.4%～28.6%；毒力基因TSST-1、PVL、sed未檢出。42株致病性金黃色葡萄球菌攜帶的毒力基因的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank中登錄的金黃色葡萄球菌參考株基因序列同源性在97.0%～99.6%。

表2 致病性金黃色葡萄球菌毒力基因檢測Table 2 Virulence gene detection of pathogenic S.aureus

2.6 細(xì)菌耐藥性檢測 用K-B藥敏紙片法對(duì)分離的42株致病性金黃色葡萄球菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分析耐藥性。結(jié)果如表3所示，分離的42株致病性金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素、阿莫西林、氨芐西林、大觀霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、新霉素7種藥物耐藥性較高，耐藥率在81.0%～100%；對(duì)環(huán)丙沙星、紅霉素、磷霉素3種藥物的耐藥率在50.0%～66.7%；對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松、恩諾沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、林可霉素6種藥物耐藥率在14.3%～42.9%。

表3 致病性金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)Table 3 Drug sensitivity of pathogenic S.aureus

3 討論

葡萄球菌是存在于人類和動(dòng)物體內(nèi)的一種條件性致病菌，該菌根據(jù)脂溶性色素的生化反應(yīng)可以分為金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌3個(gè)菌種類型，其中金黃色葡萄球菌對(duì)肉雛雞的危害較大[9]。國內(nèi)關(guān)于肉雞的金黃色葡萄球菌感染的報(bào)道逐年增多，因此，在肉雞養(yǎng)殖過程中應(yīng)該引起重視。本試驗(yàn)從承德地區(qū)采集的128份病死肉雞病料組織中，分離到57株金黃色葡萄球菌，通過人工感染肉雛雞致病性試驗(yàn)，57株分離菌株中42株為致病性金黃色葡萄球菌，說明石家莊地區(qū)肉雛雞感染金黃色葡萄球菌比較嚴(yán)重，正在廣泛流行，對(duì)肉雛雞的養(yǎng)殖可能存在潛在的威脅，應(yīng)該引起重視。金黃色葡萄球菌為條件致病菌，可以通過創(chuàng)傷皮膚、黏膜等多種途徑進(jìn)行直接接觸和空氣傳播，也可以通過臍帶感染傳播，是導(dǎo)致該菌廣泛流行的主要原因[8-10]。因此，在肉雛雞養(yǎng)殖過程中應(yīng)該引起重視，注意該病防控。

國內(nèi)外相關(guān)研究表明，金黃色葡萄球菌攜帶溶血毒素、腸毒素、中毒休克綜合征毒素和粘附因子等多種毒力基因，這些毒力基因與其致病性具有一定相關(guān)性[11-12]。國內(nèi)關(guān)于肉雞源金黃色葡萄球菌的毒力基因報(bào)道較少，因此，對(duì)分離的42株為致病性金黃色葡萄球菌進(jìn)行毒力基因檢測。本試驗(yàn)結(jié)果表明，42株金黃色葡萄球菌攜帶多種毒力基因，攜帶這些毒力基因可能與致病有關(guān)。關(guān)于攜帶多種毒力基因?qū)е陆瘘S色葡萄球菌致病性的機(jī)理尚未明確，有待進(jìn)一步研究。與楊軍[8]、賀朋朋[11]，徐結(jié)等[12]報(bào)道存在一定差異性，可能與感染宿主、地區(qū)有關(guān)。由于抗菌藥在臨床中的不合理使用，致使金黃色葡萄球菌對(duì)常用抗菌藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性[13]。本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，42株金黃色葡萄球菌耐藥性嚴(yán)重。因此，在用藥的過程中應(yīng)該引起重視，注意合理用藥，同時(shí)還要注意環(huán)境的消毒。