河南省規模化兔場金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗

郭力偉，朱雪敏，孫新閣

(1.河南農業職業學院牧業工程學院，河南 洛陽 471002；2.河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種人獸共患的革蘭陽性球菌，其在自然界分布很廣，空氣、水、塵土、飼料及各種物體上都有存在，在家畜的皮膚、腸道、黏膜、扁桃腺等也有寄生，可以引起兔、豬、牛、羊、雞、鴨等多種不同動物感染。金黃色葡萄球菌病是一種高度接觸性傳染病，臨床表現以致死性敗血癥和組織器官化膿性炎癥為主要特征。該病在兔群內傳播快，其單獨感染檢出率高達37.6%[1]，給兔健康養殖帶來嚴重威脅。感染兔精神不振，食欲減少，腳底皮膚發生腫脹、破潰[2]；病死兔剖檢肝臟腫大，有明顯的壞死灶，膽囊腫大，膽汁濃稠，脾臟腫大[3]；哺乳母兔的乳房或乳頭感染時可導致乳房炎，仔兔攝入含該菌的乳汁后可引起黃尿病甚至敗血癥。

金黃色葡萄球菌(S.aureus)廣泛威脅著世界各個養兔國家，在我國流行范圍也較廣，嚴重影響著我國養兔業的發展，并且一定程度上威脅著人類健康。在對病兔進行預防治療時，人們往往盲目使用抗菌藥物來抑制細菌疾病發生，逐步加劇了兔病病原菌的耐藥性，使得兔病的治療難以達到預期效果。本試驗開展河南省規模化兔場金黃色葡萄球菌的分離、鑒定及藥物敏感性試驗，旨在確定該地區兔群金黃色葡萄球菌感染情況及相應菌株的藥物敏感性，為該地區規模化兔場金黃色葡萄球菌的分離鑒定與預防治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2019年10—12月，對河南省規模化兔場疑似葡萄球菌感染的繁殖母兔，采集4個兔場繁殖母兔的皮膚膿腫組織，進行病原菌的分離培養及檢測。

1.2 主要試劑與儀器 麥康凱瓊脂培養基、普通瓊脂培養基、藥敏紙片，均購自北京索萊寶科技有限公司；PremixTaqTM(E×TaqTMVersion 2.0 plus dye)，購自大連TaKaRa公司；溴化乙錠溶液，購自蘇州天可貿易有限公司；細菌基因組DNA小量提取試劑盒、DL-2 000 Marker、Proteinase K，均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。臺式冷凍高速離心機(Beckman Coulter)，普通PCR儀(Applied Biosystems 2720)，凝膠成像系統(BIORAD)，電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 細菌分離純化 采集繁殖母兔皮膚膿腫組織，將采集的樣品劃線接種于普通營養瓊脂培養基和麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養24 h，觀察菌落的生長情況。挑取單個菌落進行涂片，革蘭染色，鏡檢，選擇鏡檢結果為革蘭陽性紫色球菌的菌落進一步劃線純化后進行后續試驗。

1.4 引物設計與合成 選取GenBank上發布的金黃色葡萄球菌16S rDNA基因序列，經DNASTAR軟件對比分析后，利用Primier 5.0軟件設計1對金黃色葡萄球菌引物，引物序列見表1。預擴增目的片段大小約為480 bp。引物由安徽通用生物系統有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 PCR鑒定

1.5.1 細菌DNA的提取 取分離純化后的菌液，按照細菌基因組DNA小量提取試劑盒說明書上的步驟進行細菌DNA的抽提。

1.5.2 PCR擴增反應體系(25 μL) PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，上述提取DNA 1 μL。反應條件：94 ℃變性 4 min后進行循環；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。擴增后的PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6 藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的K-B紙片法進行試驗操作和結果判斷[4]。抗生素紙片包括：青霉素、紅霉素、慶大霉素、環丙沙星、四環素、羧芐西林、哌拉西林、氨芐西林、苯唑西林、克林霉素、萬古霉素、麥迪霉素、卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢呋辛、頭孢拉定、呋喃唑酮、多黏菌素B、頭孢哌酮。

2 結果

2.1 分離菌的形態特征 將樣品接種于培養基上培養24 h后，在普通肉湯上生長迅速，均勻渾濁，管底有少量沉淀，輕輕振蕩，沉淀物上升，隨即消散，不產生菌膜。在普通瓊脂培養基上形成光滑、濕潤、隆起、邊緣整齊、不透明的圓形菌落，放置一段時間后變為金黃色(見中插彩版圖1)，麥康凱培養基上不生長。涂片進行革蘭染色，鏡檢可見大量革蘭陽性、短鏈狀或成對或葡萄串狀的球菌(見中插彩版圖2)。從采集的4個兔場繁殖母兔組織中共獲得4個疑似菌株。

圖1 分離菌在普通瓊脂培養基上生長 (200×)Fig.1 Isolation bacteria grow on common agar medium (200×)

圖2 細菌革蘭染色 (200×)Fig.2 Bacterial gram staining (200×)

2.2 PCR鑒定 經2%瓊脂糖凝膠電泳后，在病死兔上分離得到的細菌在約480 bp處出現特異性條帶(圖3)。由PCR鑒定結果證實，7只繁殖母兔感染細菌為金黃色葡萄球菌。

圖3 細菌PCR擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of the PCR amplified genes from the bacteria isolatesM:DL-2 000 DNA marker；1：金黃色葡萄球菌16S rDNA PCR擴增產物M:DL-2 000 DNA marker；1:Staphylococcus aureus 16S rDNA PCR amplification products

2.3 藥敏試驗 將金黃色葡萄球菌接種到培養基上進行藥敏試驗。分離得到的金黃色葡萄球菌菌株對不同藥物的敏感性見表2。由表2可知，金黃色葡萄球菌對慶大霉素、羧芐西林、哌拉西林、卡那霉素4種藥物敏感，對頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢哌酮、青霉素、紅霉素、環丙沙星、氨芐西林、苯唑西林、克林霉素、萬古霉素、麥迪霉素、頭孢呋辛、呋喃唑酮、多黏菌素B等多種藥物有不同程度的耐藥性。

表2 不同藥物對金黃色葡萄球菌菌株的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of different drugs on Staphylococcus aureus strain

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種非常重要的條件致病菌，能夠引起人和動物的局部和全身感染，導致皮膚、軟組織及器官的化膿性炎癥[5-9]。該菌是動物體內常見細菌，可以通過不同的途徑進行傳播，正常情況下與動物機體保持一種相對平衡狀態，但當動物機體受到環境條件變化時，致病菌大量繁殖，常常給動物造成嚴重感染，引起動物機體不同的病理變化。鄧家波等[10]從金絲猴淋巴結膿液中發現金黃色葡萄球菌感染；任美美[11]從患病奶牛子宮分泌物中分離純化得到了金黃色葡萄球菌。

目前，我國家兔產品產量和兔養殖量均處于世界領先地位[12]。金黃色葡萄球菌病是家兔最常感染的細菌性疾病之一。Jose等[13]從西班牙不同地區死兔中分離得到了多株金黃色葡萄球菌；何光志等[14]以食欲不振、皮膚出現乳白色膿腫的野兔為研究對象，發現金黃色葡萄球菌感染是造成野兔皮膚膿腫的主要原因；趙艷春等[15]在發生乳房紅腫、發熱、發硬以及乳房處形成膿腫病癥母兔群中診斷出金黃色葡萄球菌感染；彭正忠等[16]以排黃色尿樣稀糞并有腥臭味、毛色無光澤而松散、嗜睡的仔兔群為研究對象，發現了金黃色葡萄球菌是造成仔兔死亡的主要原因。感染金黃色葡萄球菌后，家兔主要表現出乳房炎、皮下膿腫、腳皮炎、仔兔黃尿病等。繁殖母兔感染金黃色葡萄球菌后發生乳房感染或乳汁帶菌，當仔兔允吸感染母兔乳汁后引發仔兔黃尿病。當仔兔感染金黃色葡萄球菌后，發病 2～3 d就陸續死亡，死亡率極高。這給我國兔養殖業，尤其是仔兔養殖帶來了極大的威脅。本試驗分離菌株經PCR擴增后，電泳得到大小為480 bp的條帶。與張國權等[17]所報道的獺兔金黃色葡萄球16S rDNA鑒定結果一致。

根據金黃色葡萄球菌的流行特點，為有效預防與控制相應感染的發生，不僅要提高其衛生環境條件，定期清理消毒，而且要提高動物機體的免疫力，抵抗病原菌的侵襲。臨床上金黃色葡萄球菌易產生耐藥性，很多抗菌素對其不敏感或效果不好，因此，通過菌株的藥敏試驗結果來選擇有效的治療藥物十分重要。本次分離得到的4株金黃色葡萄球菌的藥敏試驗，結果顯示，4株菌株均對慶大霉素、羧芐西林和哌拉西林敏感，其中3株對卡那霉素敏感，4株菌株對其他藥物都有不同程度的耐藥性。從本次細菌耐藥試驗結果分析來看，河南地區面對日益嚴重的細菌耐藥問題，必須加強對抗菌藥物的合理使用，減少細菌耐藥的發生。當兔場發生該病時，應通過藥敏試驗科學選藥，提高治療效果，減少耐藥性產生。