CRISPR-Cas結構及該系統介導的主要致病菌耐藥機制的研究進展

潘思宇,黨 喬,劉樹明,2,3，孔令聰,2,3,馬紅霞,2,3

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.動物生產及產品質量安全省部共建教育部重點實驗室，吉林 長春 130118；3.吉林省新獸藥研發與創制重點實驗室，吉林 長春 130118)

獸醫臨床致病菌在抗微生物藥物壓力下不斷進化、演變，部分菌株已對常用藥物呈現多重耐藥性，不但為獸醫臨床的抗感染治療造成了困難，也對公共衛生安全造成了嚴重威脅[1]。通常耐藥性致病菌的產生由外排泵、產生滅活酶、攜帶耐藥性質粒、可移動耐藥原件及靶位置換等介導[2]。

但近年研究發現，主要致病菌的免疫系統在抗生素壓力下不斷進化,也可在一定程度上介導耐藥性的產生。其中，聚類規則間隔回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR-Cas)系統不僅能穩定病原微生物的遺傳性，還參與細菌的生理等功能的調控，為此受到了國內外學者廣泛關注。該系統是原核生物基因組中的適應性免疫系統，能夠有效抵抗外來基因組分的入侵，維持細菌基因信息的完整性[3]，是特異性核酸的靶向防御機制。CRISPR-Cas系統的免疫功能包括3個不同的機制階段:適應、表達和干擾[4]。目前，該系統已廣泛應用于基因編輯、細菌分型等諸多領域。但Gill等首次發現了CRISPR-Cas系統可靶向外源DNA，有效阻止接合質粒的轉化，在一定程度上減少了病原菌間耐藥基因的傳播[5]。從此，CRISPR-Cas系統介導的細菌耐藥性及毒力研究引起國內外研究人員的高度關注。

1 細菌CRISPR-Cas系統結構及功能

CRISPR-Cas系統是原核生物基因組中新近發現的一種免疫防御系統，廣泛存在于細菌和古菌[6]。該系統由CRISPR位點和Cas基因組成,根據不同種類Cas蛋白的不同功能，可將該系統分為三類[4]，即Type I-III。其中Ⅰ型是整個系統中含有最豐富且復雜的蛋白系統，包含6個亞型，Cas3蛋白為最具有標記性蛋白；II型系統組分相對單一，啟動免疫系統僅需要Cas9蛋白的參與[7]；III類系統包含兩大標志基因,需要多個Cas蛋白共同作用切割目的基因[8]。

Cas蛋白通常攜帶能夠結合聚合酶、核酸酶及解旋酶的功能域，參與免疫的多個階段[4,9]。Sternberg等解釋了CRISPR-Cas免疫系統的工作原理，當一種細菌識別病毒或質粒侵入時，將外源DNA整合到CRISPR單元中作為新的間隔序列，再將CRISPR單元轉錄為pre-crRNA，產生的crRNA與入侵病毒或質粒結合并使其沉默[10],進而啟動免疫系統。在適應階段，外源DNA插入CRISPR位點的重復序列和間隔序列，這些序列被轉錄成crRNA。在靶向過程中，成熟的crRNAs與Cas蛋白組裝破壞外源核酸[11]。在表達階段，反式編碼RNA和pre-crRNA結合為復合體與Cas9結合對靶向DNA進行切割[12]。在干擾階段，III類CRISPR系統中許多蛋白發揮相應的作用，Cas6蛋白參與crRNA的成熟及其前體的初加工，成熟后的crRNA與Cas復合體相結合對DNA進行靶向切割[13](表1)。

表1 CRISPR-Cas系統組分及作用機理

2 CRISPR-Cas系統對細菌耐藥性調控作用

相關研究表明，完整的CRISPR-Cas系統不僅可有效地抵抗外來入侵物質，同時影響細菌包膜的完整性。Sampson團隊[14]通過改變脂質A介導的外膜蛋白及增加電荷，從而使菌株可對多黏菌素產生相應抗性。Cas9缺陷株的生長能力在不同濃度抗生素壓力下呈現不同趨勢，而對Cas9回補株幾乎沒有影響。國內研究人員也證明,缺失Cas3基因的突變鏈球菌的生物被膜形成能力與野生株相比明顯減弱，同時對氟敏感性也顯著增加[15]。

對于許多致病性細菌，抗生素耐藥性主要是通過獲得外源DNA介導且被編碼整合于可移動元件上，包括質粒、基因島及整合子等。已有研究報道，CRISPR-Cas與細菌耐藥存在一定關系。McDonald等[16]確定了70多弧菌科的多種不同的CRISPR-Cas系統類型，這些系統主要分布在可移動原件中,I-F系統也在整合酶基因島附近。王琳琳[17]在多重耐藥志賀菌中分別檢測出四環素類、B-內酰胺類、氟喹諾酮類等耐藥基因，這些耐藥基因均存在于CRISPR間隔序列較少的菌體內，進一步推測多重耐藥株的CRISPR間隔物缺失可影響菌株獲得多重抗生素耐藥性。而CRISPR-Cas免疫系統的缺失可能會促進細胞在特定條件下的生存,例如在抗微生物藥物的壓力下抗性基因的獲取等。關于糞腸球菌CRISPR-Cas系統與耐藥適應性的相關報道表明，該系統的部分缺失與獲得性耐藥呈正相關[18-19]。已報道糞腸球菌含有一些能夠獨立復制的質粒和致病島，這些元件上均分布了抗性基因與毒性因子，CRISPR-Cas系統以上述元件為靶向位點，并檢測到糞腸球菌中存在相關耐藥基因[21]。此外，Palmer[21]發現構成多重耐藥腸球菌的基因組中，25%來自可移動元件，且與CRISPR間隔序列高度一致，促進質粒自身轉移進一步影響染色體的編碼及Cas位點移動和部分堿基突變，從而使腸球菌產生獲得耐藥性，為此強調CRISPR在腸球菌內整合基因組的重要性。對表皮葡萄球菌的研究發現，非致病性菌體缺乏CRISPR序列，而在攜帶質粒的致病性菌體內檢測到CRISPR序列，能夠有效的阻止接合質粒的轉移，在一定程度上減少了耐藥基因在病原菌間的轉移[5]。同時，Eva等[7]在弗朗西斯菌中發現了存在于II型系統中的一種scaRNA，不同于tracrRNA和crRNA的作用機理,這種小分子由Cas9介導使RNA相互作用降低蛋白轉錄，從而抑制抗原的表達并降低宿主促炎性反應。綜上所述，不同菌種的CRISPR系統均參與了細菌耐藥性的調控，為日后細菌耐藥性的研究提供了重要的理論基礎。

另外，CRISPR系統除了抵御外來物質入侵外，還能控制內源性轉錄，參與調解細菌致病性[22]。CRISPR系統的缺失可明顯導致細菌致病性的變化。最新研究表明，Cas9的缺失可降低細胞上皮細胞粘附，影響數種調控毒力的蛋白表達，而Cas9作為毒力因子的作用機制尚不明確，推測Cas9基因與編碼毒力決定因素的基因協同調控病原菌的毒力性，同時抑制毒性決定基因的轉錄[12]。CRISPR系統不僅能增強生物膜形成能力，同時Cas9還參與了宿主先天免疫的逃避通路并有效抑制抗原的表達，這種天然機制也使細菌逃避多種宿主受體的免疫機制而提高自身毒力[14]。此外，值得注意的是缺乏CRISPR序列的菌株擁有更多的原噬菌體，CRISPR靶標的分析表明，間隔序列與其原噬菌體靶標之間存在相互排斥的關系，干擾毒力因子在病原菌間轉移[23]，這說明CRISPR-Cas可拮抗原噬菌體的插入，從而影響病原體的進化，但其二者相互影響及作用機制仍需進一步開展研究。

3 展望

CRISPR-Cas系統作為細菌常在的天然免疫防御系統，一方面，CRISPR免疫系統阻止抗生素抗性基因和毒力基因向病原菌轉移，從而降低病原菌的進化能力;另一方面，該系統能有效對抗入侵的外源性遺傳物質，其獨特的功能特性不僅調控微生物耐藥適應性并介導耐藥基因與毒力基因的表達。本實驗室針對革蘭陽性和陰性多重耐藥致病菌，如腸球菌、巴氏桿菌及肺炎克雷伯菌等進行CRISPR-Cas系統的檢測,結果與已報道結論相似。CRISPR-Cas缺失株與野生株相比，Cas基因的缺失不僅影響細菌的耐藥性同時潛在的使部分耐藥基因發生表達沉默，部分功能基因表達量發生顯著上調，間接影響細菌在抗生素壓力下的生長速率，但CRISPR-Cas是如何介導致病菌耐藥性及其相關機制仍需要我們進一步展開研究。不同生物體內的CRISPR免疫通路與執行相應功能蛋白有所不同，Cas 蛋白家族在實現精確整合CRISPR序列的功能上發揮著重要作用，通過與向導RNA和篩選標記結合，可快速篩選出全基因組范圍內潛在的靶點基因，以期為分子生物領域研究提供重要的基因工具。