不同佐劑GnRH疫苗對大鼠去勢作用的試驗

李思潔，呂傳忠，任東興，陳 庚，李建軍，付旭彬

(1.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 西青 300384；2.天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 空港 300308)

寵物去勢目前普遍采用的是外科閹割法，容易引起強烈應激反應和術后感染，也易引起并發癥[1]。免疫去勢是利用促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)類似物作為抗原刺激機體產生抗體，從而中和機體自身產生的GnRH，破壞下丘腦-垂體-性腺軸的正常反饋調節，是一種可替代外科手術的閹割方法[2]。

GnRH序列在哺乳動物中除豚鼠外完全一樣，美國野生動物研究中心研究證實，同種GnRH疫苗均可以使土撥鼠、白尾鹿和野貓免疫去勢效力維持3年以上[3-5]，Finstad等[6]研究也發現，大鼠、犬和猩猩3個物種用同一種GnRH疫苗進行免疫可產生相同的免疫去勢效果。本試驗以大鼠為試驗動物，將設計的GnRH抗原與5種不同的佐劑相配伍，以血清睪酮含量和GnRH抗體滴度為判斷標準，以期篩選出適合寵物用的合成肽免疫去勢疫苗佐劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 合成肽去勢疫苗抗原，由天津瑞普生物技術股份有限公司合成，分子量為4 085.876；油包水佐劑(Montanide ISA 61 VG)、水包油包水佐劑(Montanide ISA 201 VG)、水包油佐劑(Montanide ISA 15A VG)、納米水溶性佐劑(Montanide IMS 1313 VG)，由法國賽彼科公司生產；鋁膠佐劑，由美國Thermo Fisher公司生產；自制GnRH抗體檢測ELISA試劑盒。

1.1.2 儀器設備 多肽合成儀(型號PSI200D)，由美國多肽公司生產；高速剪切分散乳化機，由FLUKO公司生產；酶聯免疫檢測儀，由美國Bio-RAD公司生產。

1.2.3 血清睪酮濃度檢測 采用碘[125I]睪酮放射免疫分析法，委托北京北方生物技術研究所有限公司檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 疫苗制備 Montanide ISA 61 VG∶抗原溶液=13∶7(v/v)；Montanide ISA 201 VG∶抗原溶液=11∶9(v/v)；Montanide ISA 15A VG∶抗原溶液=7∶5(v/v)；Montanide IMS 1313 VG∶抗原溶液=1∶1(v/v)；鋁膠佐劑∶抗原溶液=3∶7(v/v)。201 VG、15A VG和61 VG的制備方式為高速剪切乳化；1313 VG和鋁膠佐劑的制備方式為震蕩混勻。經性狀檢驗、無菌檢驗合格后分裝。

1.海上偵察預警。組建海上民兵偵察預警分隊，發揮海上氣象水文熟、航行路線熟、島礁分布熟、敵我船舶熟等優勢，發揮他們海上“流動哨”“報信鴿”的作用，采取“全域偵察、蹲點控守、游弋偵巡、島礁巡查、電子偵測”等辦法，運用化裝偵察、接力偵察、區域偵察、信號偵察等手段，建立覆蓋全海域的聯合偵察預警體系，組織海上偵察補盲、攝錄報知，以及引導我方對敵實施精確打擊等行動。

1.1.4 結局指標 ①上消化道出血發生率；②病死率；③血鈣濃度；④血磷濃度；⑤血鎂濃度；⑥甲狀旁腺激素（PTH）水平；⑦堿性磷酸酶（AKP）水平；⑧血肌酐水平；⑨腎小球濾過率。

表1 試驗設計Table 1 Test design

1.1.3 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠60只，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

2.3 免疫去勢大鼠睪丸大小和重量 與空白對照組相比，試驗組睪丸重量極顯著下降(P<0.01)。其中油包水佐劑組睪丸萎縮程度最大，重量達到空白對照組的1/6左右；其次是水包油包水佐劑組睪丸重量達到空白對照組的1/3，納米水溶性佐劑組、水包油佐劑組和鋁膠佐劑組的睪丸萎縮效果較差，睪丸重量是空白對照組的1/2以上(見表2)。

2.1 血清睪酮濃度檢測 血清睪酮濃度檢測發現，不同個體、不同時期的血清睪酮濃度波動較大。在13～23周齡試驗組血清睪酮濃度均顯著低于空白對照組(P<0.05)。油包水佐劑組和水包油包水佐劑組在15～23周齡血清睪酮濃度均低于0.1 ng/mL，油包水佐劑組與水包油包水佐劑組的血清睪酮濃度差異不顯著(P>0.05)。15～23周齡時，水包油包水佐劑組與水包油佐劑組、納米水溶性佐劑組和鋁膠佐劑組比較，血清睪酮濃度顯著下降(P<0.05)。水包油佐劑組、納米水溶性佐劑組和鋁膠佐劑組在免疫后血清睪酮濃度有不同程度的下降(見中插彩版圖1)。

1.2.6 睪丸H.E.染色石蠟切片 取空白對照組與水包油包水組大鼠睪丸，制作組織切片并鏡檢。

1.3 數據分析 試驗結果以“平均值±標準差”方式表示。使用軟件SPSS 23.0對數據進行方差分析，多重比較方法為LSD法。P<0.05表示數據在統計學上具有顯著差異；P<0.01表示數據在統計學上具有極顯著差異。

1.2.2 動物試驗程序 將60只SD大鼠隨機分為6組。于9周齡首免，11周齡進行二免，每次0.5 mL/只，免疫方式為背部皮下注射。于首免前眼球后靜脈叢采血，從首免開始每隔2周采血1次，直至第23周齡試驗結束；分離血清，分裝后保存于-20 ℃待檢。試驗設計如表1。

對于關鍵控制點的確定來說，主要是將控制危害風險以及嚴重性作為重要依據，對食品質量關鍵影響因素進行綜合分析，進一步確定關鍵控制點。當處于冷鏈物流之中時，流通食品發生腐爛的可能性更大，針對此需要嚴格控制多項環節與內容，主要有避免細菌污染以及冷凍工藝等。比如水產品，預冷工作從開始階段便要進行，確定關鍵控制點為預冷溫度以及方法。在進行運輸時，將各種類型的食品存放在同一輛冷藏車中，不同存儲區溫度要有所差異，盡量防止食品交叉感染問題的出現。此外，還應該嚴格控制加工以及裝卸等過程中的操作溫度。

2 結果

1.2.5 睪丸的測量 于23周齡對大鼠進行安樂死，摘取兩側睪丸并且除去睪丸周圍的脂肪及附睪，稱重并測量橫徑和直徑。

圖1 大鼠血清睪酮含量Fig.1 The testosterone concentration in sera of rats注：不同小寫字母表示組間差異顯著，P<0.05；下圖同Note:Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05.The same as below

2.2 GnRH抗體效價檢測 SD大鼠免疫后檢測不同時期的血清抗體水平，所有試驗組抗體滴度11周齡后均顯著高于對照組(P<0.05)，在15周齡達到最高峰，之后呈緩慢下降趨勢。油包水佐劑組平均血清抗體滴度最高，在15～23周齡抗體滴度顯著高于其他4個試驗組(P<0.05)；其次為水包油包水佐劑組，抗體滴度在15～23周齡顯著高于水包油佐劑組、納米水溶性佐劑組和鋁膠佐劑組(P<0.05)(見中插彩版圖2)。

1.2.3 元素的測定 將鋅、銅和鉻標準儲備溶液逐級稀釋成10 mg／L標準溶液。分別準確吸取鋅、銅和鉻 三 種 標 準 溶 液 各 0、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mL 于50.0 mL容量瓶中，用1%硝酸溶液定容至刻度配成0、0.1、0.2、0.4、0.5、1.0 mg／L 的混合標準溶液。 按儀器設定條件分別測定標準溶液、樣品空白溶液、樣品溶液。原子吸收分光光度計的工作參數見表2。

圖2 大鼠血清GnRH抗體滴度Fig.2 The anti-GnRH antibody titers in sera of rats

1.2.4 血清GnRH抗體效價檢測 采用間接酶聯免疫吸附法進行抗體效價的測定，TMB顯色，終止反應后讀取A450 nm值。

國內的相關研究主要集中在商務合同的文體特征和翻譯上。鄭紅蓮認為商務合同英語具有頻繁使用外來詞、專業術語和語言修飾詞的特征。凌縣華對古代商務合同古體詞的應用進行了專門研究。余莉對于“詞匯重復”進行了詳細的分析，指出詞匯重復可以確保商務合同語言的準確性。在句法和文本層面，趙翠平認為商務合同具有標準化格式，其結構準確性表現在長句、時態、語態和情態動詞方面。從中英文語言差異出發，周燕和廖瑛(2004：29-32)闡述了商務合同翻譯的策略和技巧。黃芬致力于尋找國際商務合同翻譯策略。張莉在功能翻譯理論的指導下，提出了一些商務合同的翻譯策略和技巧。

當前，基于數字理念的電氣自動化應用已在工農業領域和軍事領域，甚至人們的生活領域得到廣泛普及。在工業電氣自動化中，數字技術的應用非常深入，呈現的技術內容也相當豐富，具備重要的功能優勢。

表2 大鼠睪丸的重量與大小Table 2 Testicular weight and size of rats

2.4 睪丸組織學觀察 組織染色結果如中插彩版圖3所示，空白對照組(A、B)大鼠睪丸細胞結構完整，曲細精管內的精原細胞向管腔發育，分化明顯。水包油包水佐劑組(C、D)的大鼠睪丸萎縮明顯，曲細精管管徑萎縮，管腔中出現空泡。

圖3 大鼠睪丸組織學觀察 (H.E.染色)Fig.3 Histological observation of rat testis (H.E.staining)A:空白對照組(10×)；B：空白對照組(40×)；C：水包油包水組(10×)；D：水包油包水組(40×)A:Control group(10×);B:Control group(40×);C:Water-in-oil-in-water group(10×);D:Water-in-oil-in-water group(40×)

3 討論

寵物用疫苗對佐劑安全性要求較高，刺激性強的佐劑會引起注射部位皮膚瘙癢、紅腫、疼痛、膿腫等不同程度炎癥反應，甚至會引起惡性纖維腫瘤[7]。因此，寵物用滅活疫苗一般都采用刺激性弱的鋁膠佐劑。研究發現，鋁膠作為高純度的小分子蛋白抗原佐劑時不能產生足夠的抗體應答[8]，合成肽抗原分子量遠小于蛋白抗原，以鋁膠作為佐劑可能會影響其免疫原性，篩選出一種免疫刺激性強、安全性高的佐劑已成為寵物合成肽去勢疫苗開發的關鍵。

本試驗GnRH疫苗血清抗體滴度顯示，水包油包水佐劑組抗體滴度低于油包水佐劑組，但是明顯高于水包油、納米水溶性和鋁膠佐劑組的抗體滴度。血清睪酮濃度結果顯示，油包水佐劑組和水包油包水佐劑組在15～23周齡時血清睪酮濃度均降低到0.1 ng/mL以下(在免疫去勢試驗中，一般將血清睪酮濃度低于0.1 ng/mL作為免疫去勢有效性的判斷標準[9])，水包油、納米水溶性和鋁膠佐劑組在二次免疫后雖然血清睪酮濃度顯著低于空白對照組(P<0.05)，但免疫有效率最高分別為70%、60%和60%，大鼠個體間免疫應答反應差異較大，從而會導致臨床應用中免疫失敗率較高。在一些研究中也發現，鋁膠佐劑、水包油佐劑需要連續免疫3次才能產生較好的免疫去勢效果[10]。試驗SD大鼠睪丸萎縮程度與血清睪酮和抗體的試驗結果相一致。

油包水佐劑免疫去勢效果雖然優于其他4種佐劑，但大量研究發現，油包水佐劑免疫副反應嚴重，注射后可引起無菌化膿和肉芽腫,并且油潴留于組織中無法完全代謝，對機體產生長期不良影響，甚至導致癌變[7]。因此，在寵物用疫苗中一般不采用油包水劑型。水包油包水佐劑是一種雙相佐劑，油相成分含量大幅度降低，可以誘導長期免疫應答，且疫苗吸收良好，殘留低，在接種部位引起的炎癥反應小[11]。有研究發現，本試驗所選用的水包油包水佐劑皮下免疫會產生輕微局部疼痛，但免疫耐受性極好，抗體滴度可維持2個月，效果優于水包油佐劑[12]。本試驗也證實，水包油包水佐劑對合成肽去勢疫苗抗原的免疫增效作用優于水包油、納米水溶性和鋁膠佐劑，在免疫14周后免疫去勢有效率仍然達到100%，可以替代油包水佐劑作為安全性高、增效作用佳的寵物用合成肽去勢疫苗的候選佐劑。