豬SLA-1分子結合多肽特性分析及功能驗證

巴利民,王振豹,齊 鵬,汪 明，肖 進，喻長遠

(1.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 朝陽 100029；2.中牧實業股份有限公司 農業部獸用生物制品與化藥重點實驗室 北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心，北京 海淀 100095；3.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193)

SLA I 類分子(豬白細胞抗原，Swine leukocyte antigen)在豬的免疫反應中起到十分重要的作用[1]，內源化病原微生物的加工、呈遞主要依賴該分子的介導，同時激活相應的細胞毒性T細胞(CTL細胞)進而引起機體產生細胞免疫反應。故而，SLA I 類分子對機體抵抗病原微生物的侵染、腫瘤治療等方面均起到極其重要的作用[2-3]。目前新一代獸用亞單位疫苗因其自身特點，研發相對較多，但是與全病毒疫苗相比，在免疫效果上要略差一些，因此，為了提高其免疫保護性，一個策略就是增加免疫反應的種類，即增加一定程度的細胞免疫。另外對一些常見的以細胞免疫應答“為主”的豬病毒性疫病疫苗的研發也有一定的積極意義。本試驗對豬群中表達頻率較高的豬SLA-1(SLA-1*080101)等位基因進行分析，考察其呈遞多肽錨定殘基特點，利用表位預測軟件對口蹄疫病毒進行抗原表位預測，并通過動物試驗進行功能驗證。該研究將為研發具有激發細胞免疫的亞單位疫苗奠定基礎，另外對于加強市場現有口蹄疫疫苗的保護效果有一定的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胎牛血清(FBS)和RMPI 1640培養基，均購自北京邁晨科技有限公司；豬用淋巴細胞分離液，購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；陽性刺激物和豬IFN-γ酶聯免疫斑點檢測試劑盒，均購自北京旭和源生物科技有限公司。

1.2 豬SLA-1分子結合多肽特性分析 利用seq2Logo工具對豬SLA-1分子結合多肽特性進行分析，同時創建多肽特征并使其可視化。主要原理是基于SLA I 類分子呈遞多肽功能的特性，重點考察第2位和第9位的呈遞多肽殘基，以直觀圖例的方式將氨基酸基序表示出來。

1.3 表位多肽的預測與合成 本文通過計算機程序NetMHCpan-4.0對口蹄疫病毒CTL表位進行預測，同時結合1.2中方法結果，以期獲得豬SLA-1*080101等位基因的潛在結合多肽。按照此方法，獲得6條預測的可能性較高的CTL表位多肽，然后通過固相合成法合成并利用高效液相色譜純化，使其純度大于90%。

1.4 疫苗配制 為了減少實驗動物使用數量，保障動物福利，本試驗選取3種CTL表位多肽抗原混合為一組(第1組P1、P2、P3，第2組P4、P5、P6)配制疫苗。具體配制方法如下：每組苗各取多肽抗原3 mg，分別用50 mL PBS稀釋至每種多肽抗原濃度為60 μg/mL，過濾除菌制成抗原相；將上述液體與50 mL佐劑配制成疫苗。

1.5 動物免疫 按照表1進行動物免疫，所選動物為口蹄疫抗體陰性的三元雜交豬，每頭動物耳根后肌內注射指定疫苗1 mL，每種疫苗免疫5頭動物，同時設置未免動物空白對照組3頭。

免疫動物28 d后，采集免疫動物全血，分離外周血淋巴細胞，進行細胞因子檢測試驗，該試驗可以用每種多肽抗原單獨刺激相應外周血淋巴細胞，考察細胞因子的分泌情況，達到CTL表位肽篩選目的。

1.6 細胞因子的檢測(IFN-γ)

1.6.1 豬外周血單個核細胞(PBMC)的分離 取抗凝血小心加到等體積的淋巴細胞分離液液面上，于20 ℃，2 000 r/min(700 g)離心20 min。離心后中間層為淋巴細胞分離層(灰白色云霧層)，吸取該層至15 mL的離心管中。用Hank′s液洗滌細胞2次，計數，用RPMI 1640培養基調整細胞濃度為3×106個/mL待用。

1.6.2 Elispot試驗檢測IFN-γ水平 本試驗采用酶聯免疫斑點(Elispot)試驗對采集分離的免疫動物外周血淋巴細胞進行細胞因子IFN-γ的檢測，具體方法按照IFN-γ酶聯免疫斑點檢測(Elispot)試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 豬SLA-1分子結合多肽特性 利用seq2Logo工具對豬SLA-1分子(SLA-1*080101)結合多肽特性進行分析，以直觀圖例的形式進行表示，具體如圖1。

在圖1中，縱坐標方向每個字母的相對高度與該位置上相應氨基酸的頻率成比例。由此可見，SLA-1*080101等位基因結合多肽的第2位氨基酸偏好L、V、I、T、M，第9位氨基酸偏好于Y、F和M。故而本試驗確定該等位基因的結合多肽殘基基序為：X-(L/V/I/T/M)-X-X-X-X-X-X-(Y/F/M)。

結合以上第2位和第9位結合氨基酸的種類特點，輔以計算機程序NetMHCpan-4.0對口蹄疫病毒緬甸98株的VP1結構蛋白序列進行預測，結果獲得如下表2中口蹄疫病毒CTL表位。這些表為具有預測分值高，同時具有SLA-1*080101等位基因結合多肽的第2位和第9位氨基酸特性，故而選擇其作為后續功能驗證用多肽抗原。

表2 預測獲得的口蹄疫CTL表位Table 2 The CTL epitope peptides from the FMDV by silico prediction methods

2.2 Elispot試驗結果 動物免疫28 d后采集全血，使用淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞，應用試劑盒檢測細胞因子含量。具體結果如圖2，對照組為6條多肽抗原混合后分別刺激空白對照組的3頭豬只的外周血淋巴細胞的結果；P1、P2和P3為該3條多肽分別單獨刺激免疫組1的5頭豬只外周血淋巴細胞產生的IFN-γ數量；P4、P5和P6為該3條多肽分別單獨刺激免疫組2的5頭豬只外周血淋巴細胞產生的IFN-γ數量。

圖2 豬只免疫28 d后IFN-γ的表達水平Fig.2 The expression level of IFN-γ in swines at 28 days post immunization

從圖2可以看出，本文通過軟件預測和seq2Logo工具確定的6條多肽抗原免疫試驗動物以后，有4條多肽抗原相對于空白對照組，可以不同程度上導致實驗豬只的IFN-γ水平上調。但是在這4條多肽抗原的試驗結果中，多肽抗原P1和P4導致IFN-γ表達水平上調最為明顯，與空白對照組差異極顯著。而多肽抗原P3和P6對IFN-γ表達水平上調作用相較于多肽抗原P1和P4要弱。多肽抗原P2和P5沒有導致IFN-γ表達水平的上調，這2條肽中，P2的第9位和P5的第2位氨基酸殘基與seq2Logo工具確定的氨基酸基序不符，可能是導致未刺激明顯IFN-γ的原因，這也從另一方面證實本試驗確定的結合多肽殘基基序的可靠性。

3 討論

通過解析的SLA I類分子結構可以知道，一般情況下該分子包含6個口袋，在結合槽上從N端到C端的順序分別為A、B、C、D、E和F口袋[4]。研究表明，構成這些口袋的氨基酸的大小、帶電性質和化學特性等特征均有所差別，導致了結合的錨定殘基的種類也不同[5]。這就決定了SLA I類分子結合抗原肽的序列有特定的規律和特點。在這6個口袋中，B口袋和F口袋對SLA I類分子與多肽形成的復合物的穩定性影響相對較大，其所容納的多肽殘基稱為初級錨定殘基(即多肽的第2位和第9位氨基酸殘基)，為多肽抗原的特征殘基，故而本文重點研究在商品豬中出現頻率較高的SLA-1*080101等位基因所遞呈多肽的特點，結果獲得了這個等位基因蛋白結合多肽殘基基序為：X-(L/V/I/T/M)-X-X-X-X-X-X-(Y/F/M)。該基序對于預測和設計針對SLA-1*080101等位基因的多肽抗原有重要指導意義。

另外本文通過動物試驗，利用測定細胞因子方法進一步證實了口蹄疫病毒上針對SLA-1*080101等位基因的CTL表位多肽，獲得2條具有細胞免疫反應的多肽抗原(P1和P4)。目前在研和在售的口蹄疫合成肽疫苗產品均是以體液免疫為主，很少能夠刺激起較強的細胞免疫反應，為了提高此類合成肽疫苗的免疫反應和保護效果，有必要研究細胞免疫反應多肽抗原。本文獲得的2條CTL表位多肽將有助于開發口蹄疫細胞免疫疫苗，完善現有產品性能，對口蹄疫的防治工作具有重要的意義。