雞球蟲病三價四株活疫苗實驗室效力試驗

雷 璇，鄭明學，郭鈺玨，白 瑞，張 黎，張雪松，康慧鑫，李瑞琪，殷莉陽，楊洪靜，王 辰，郭露露

(山西農業大學動物醫學學院，山西 太谷 030801)

雞球蟲病會給世界禽類產業造成巨大的經濟損失[1]。目前控制雞球蟲病的方法是使用抗球蟲藥物和球蟲病活疫苗，但抗球蟲藥物導致了很多問題的出現[2-3]，且強毒株球蟲病活疫苗會使雞只出現較大的損傷，影響其生長性能。雞球蟲病三價四株活疫苗采用早熟弱毒株，致病性弱，對雞的生長性能影響小且含2種巨型艾美耳蟲珠，具有較廣的抗蟲范圍。為保證雞球蟲病三價四株活疫苗的免疫效果，本實驗室對該疫苗進行了最小免疫劑量試驗、最小首免日齡試驗、最小二免間隔期試驗、免疫產生期和持續期試驗以及網上平養和地面平養試驗。

1 材料與方法

1.1 疫苗和蟲株 雞球蟲病三價四株活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲PTSX株+巨型艾美耳球蟲PMSX株+巨型艾美耳球蟲PMSD株+堆型艾美耳球蟲PASX株)(每毫升疫苗液中含PTSX3.0×105個孢子化卵囊、PMSX3.0×104個孢子化卵囊、PMSD3.0×104個孢子化卵囊、PASX1.2×105個孢子化卵囊)，以上蟲株均由山西農業大學獸醫病理實驗室保存與提供。

1.2 實驗動物 SPF雛雞由北京Merial SPF種蛋孵化而來。

1.3 最小免疫劑量試驗 將網上平養的4日齡SPF雛雞隨機分為12組，10只/組，分別為一次免疫攻毒組(T11～T14)、二次免疫組(T21～T24)、攻毒對照組(C1、C2)和空白對照組(C01、C02)。使用不同劑量的雞球蟲病三價四株活疫苗分別于4日齡對T11～T14和T21～T24組首免，14日齡對T21～T24組二免，各組免疫劑量見表1。T11～T14和C1組于一免14 d、T21～T24和C2組于二免14 d空腹稱重后攻擊檢驗用混合強毒(PTSX4.0×104、PASX20.0×104、PMSX15.0×104、PMSD15.0×104個孢子化卵囊/只)；C01(18日齡空腹稱重)和C02(28日齡空腹稱重)不接種不攻毒。攻毒后連續7 d觀察雞只臨床狀況(精神狀態、食欲和死亡情況等)并記錄。攻毒第7天末剖檢所有雞只，觀察記錄十二指腸、小腸中段和盲腸的病理變化，并進行病變記分，計算平均值。選擇能達到免疫效力標準的最低劑量作為最小免疫劑量。

1.4 最小首免日齡試驗 將網上平養的4日齡SPF雞隨機分為9個組，每組10只，包括1個空白對照組(C0)、4個不免疫攻毒組(C1～C4)和4個免疫攻毒組(T1～T4)。免疫攻毒組以最小免疫劑量，分別于2、3、4日齡和5日齡進行一次免疫，一免第10天以2倍最小免疫劑量進行二次免疫，免疫后第14天同1.3項攻檢驗強毒，攻毒后觀察和測定指標除1.3項外，同時計算每組雞只的平均增重、相對增重以及死亡率，選擇能達到免疫效力標準的最小免疫日齡作為最小首免日齡。

1.5 最小二免間隔期測定 將網上平養的SPF雞隨機分為11個組，每組10只，分別為1個空白對照組(C0)、5個不免疫攻毒組(C1～C5)和5個免疫攻毒組(T1～T5)。免疫攻毒組以最小免疫劑量分別于4日齡進行一次免疫，一次免疫后在第7、8、9、10天和第11天以2倍最小免疫劑量進行二免，免疫后第14天同1.3項攻檢驗強毒。攻毒觀察和測定指標同1.4項，選擇能達到免疫效力標準的最低二免間隔作為最小二免間隔期。

1.6 免疫產生期和持續期試驗 將網上平養的SPF雞隨機分為13個組，每組10只，分別為1個空白對照組(C0)、6個不免疫攻毒組(C1～C6)和6個免疫攻毒組(T1～T6)，T1～T6組以1倍和2倍最小免疫劑量分別于4日齡和14日齡進行一次、二次免疫，二免后第6、10、14、28、42、56天攻混合強毒(劑量同一免)。所有雞只在飼養過程中按常規進行雞新城疫、禽流感、傳染性法氏囊、傳染性支氣管炎免疫接種。攻毒觀察指標和方法同1.4項，選擇以免疫后免疫力最早能達到效力檢驗標準的時間為免疫產生期；以免疫后免疫力可保持達到效力檢驗標準的最長時間為免疫持續期。

1.7 網上平養和地面平養對免疫效果的影響 SPF雞隨機分為4個組，每組10只，分別為空白對照組(C0)、不免疫攻毒組(C1)、網上平養免疫攻毒組(T1)和地面平養免疫攻毒組(T2)，免疫攻毒組以推薦免疫劑量1羽份和2羽份分別于4日齡、14日齡進行一次和二次免疫，二次免疫后第14天同1.3項攻檢驗強毒。攻毒后進行觀察，指標和方法同1.4項，判斷該疫苗是否適合于網上和地面平養。

1.8 檢測指標及判定標準

1.8.1 檢測指標

(1)增重：

平均增重=(每組總終體重-每組總初體重)/每組總雞只數

相對增重率(RWG)=(試驗組的平均增重/空白對照組的平均增重)×100%

(2)死亡率：

死亡率=(每組死亡雞只數/每組總雞只數)×100%

(3)腸道病變記分:參考Johnson和Reid法[4]和《獸用生物制品質量標準匯編》(2008版)[5]分別在第7天對十二指腸、空腸和盲腸進行病變記分。

1.8.2 免疫效果判定標準 參照《獸用生物制品質量標準匯編》(2008版)和佛山正典的雞球蟲病三價活疫苗的標準[6]，結合本實驗室早熟株和檢驗用強毒株的特性，將本疫苗效力檢驗的標準定為：攻毒對照組，雞的十二指腸、盲腸的平均病變記分≥3.00，空腸平均病變記分≥2.00，死亡率為40.0%～50.0%；免疫攻毒組，雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分應≤1.50，其中至少8只雛雞3個 腸段的病變記分應≤1.0，死亡率≤10.0%。

2 結果

2.1 最小免疫劑量 一次免疫后，各組雞均未見明顯異常，隨免疫劑量增加，免疫組雞平均增重、相對增重率逐漸降低，免疫組攻毒前的相對增重率在80%左右，見表2；攻毒后除一免(T11、T12)兩組和攻毒對照組(C1組)死亡率為10.0%、10.0%和40.0%外，其余各組均無死亡。攻毒后，免疫攻毒組各腸道平均病變記分隨免疫劑量增加逐漸降低，免疫組腸道平均病變記分極顯著低于攻毒對照組(P<0.01)。當雞球蟲病三價四株活疫苗一次免疫劑量≥7 200個孢子化卵囊/只時，免疫攻毒組至少9只雞各腸道病變記分均≤1.0，達到良好免疫效果，見表3。

二次免疫試驗在免疫后未見明顯異常，攻毒后除C2組死亡率為40.0%外，其余各組均無死亡。攻毒后，隨免疫劑量增加，腸道平均病變記分逐漸降低；除T21組外，其余各免疫組腸道平均病變記分均≤1.0，極顯著低于攻毒對照組(P<0.01)。當雞球蟲病三價四株活疫苗一免/二免劑量分別≥1 600和3 200個孢子化卵囊/只時，免疫攻毒組至少9只雞各腸道病變記分均≤1.0，死亡率≤10.0%，達到了良好免疫效果，免疫組攻毒前的相對增重率均高于90%，見表2和表3。

表2 一次免疫與二次免疫接種對雞增重的影響Table 2 Effects of first and second immunization on average weight gain in chickens

表3 一次免疫與二次免疫攻毒組的腸道病變情況Table 3 Intestinal pathological changes in groups of first and second immunization

2.2 最小首免日齡 免疫雞只在免疫期內糞便未見異常也沒有出現死亡。攻毒后，隨著首免日齡的增大RWG也相對提高。首免日齡≥4日齡(T3和T4組)免疫攻毒組雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，均顯著低于(P<0.05)不免疫攻毒組雞(C1～C4組)。其中至少9只雛雞3個腸段的病變記分均≤1.0，死亡率≤10.0%，符合效力檢驗標準，見表4。

表4 最小首免日齡測定結果Table 4 Results of minimum first immunization ages test

2.3 最小二免間隔 RWG隨著二免間隔的增大而提高。所有免疫攻毒組均符合效力檢驗標準即免疫攻毒組雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，且至少8只雛雞3個腸段的病變記分≤1.0，死亡率≤10.0%，見表5。

表5 最小二免間隔測定結果Table 5 Results of minimum second immunization interval test

2.4 免疫產生期和持續期測定 雛雞在一次免疫后第10～14天(T1～T6組)產生了部分的免疫力，但不符合效力檢驗標準。二次免疫后≥6 d攻毒組(T1～T6組)雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，其中至少8只雛雞3個腸段的病變記分均≤1.0，死亡率≤10.0%，均符合免疫攻毒組的效力檢驗標準，見表6。

表6 免疫產生期和持續期測定結果Table 6 Results of producing immunity time and immunity duration test

2.5 網上與地面平養的效果測定 網上平養免疫攻毒組(T1)和地面平養免疫攻毒組(T2)雞只平均增重和RWG無顯著差異(P>0.05)。且T1和T2組雞均沒有出現死亡，雞的十二指腸、空腸中段和盲腸的平均病變記分均≤1.50，其中至少8只雛雞3個腸段的病變記分均≤1.0，符合效力檢驗標準，見表7。

表7 網上平養與地面平養對疫苗免疫的影響Table 7 The influence of rearingon floorand in battery on the vaccine immunity

3 討論

雞球蟲病活疫苗的免疫效力在一定劑量范圍內會隨著免疫劑量的增大而提高[7]。免疫接種球蟲卵囊后機體對球蟲的免疫力隨著時間延長而降低，但也會隨著再次接種而增強，且在二次免疫中一免提供的免疫力更強，也能夠保持更長時間，因此對于增強免疫力反復接種球蟲卵囊是一個較好的方法[8]。本試驗結果顯示，隨接種劑量的增高，雞只的免疫保護力也增高。當一次免疫時劑量≥7 200個 孢子化卵囊/只和二次免疫時一免/二免劑量分別≥1 600和3 200個孢子化卵囊/只時均符合免疫標準，在免疫效果合格的情況下，二次免疫接種劑量小于一次免疫。當PASX、PMSX、PMSD以及PTSX的首次免疫劑量分別≥400、100、100、1 000個孢子化卵囊/只，二次免疫劑量分別≥800、200、200、2 000個 孢子化卵囊/只時，可達到良好免疫效果，符合本疫苗效力檢驗標準。因此，在進行該疫苗的免疫時，PASX、PMSX、PMSD以及PTSX的一次免疫最小劑量分別為400、100、100、1 000個孢子化卵囊/只，二次免疫最小劑量分別為800、200、200、2 000個孢子化卵囊/只。

在日齡較小時雞免疫系統發育不成熟，不能產生對球蟲的有效免疫反應，從而導致雞只不能產生足夠的免疫力，但免疫日齡過大，在球蟲病多發期尚不能產生有效的保護性免疫反應，容易導致球蟲病的暴發[9-10]。因此，需要選擇雛雞接種后能夠產生良好抵抗力的最小日齡。本試驗選擇2～5日齡為首免范圍，結果顯示，隨著首免日齡的增大，免疫力也會隨之提高。當首免日齡≥4日齡時，免疫效果符合本疫苗效力檢驗標準，因此選取4日齡為最小首免日齡。在研究雞球蟲早熟株的首免日齡時，王麗[11]和呂強華[12]發現雛雞的首免日齡在4～6日齡范圍內，均可以獲得良好免疫力，與本試驗結果相似。

一免后，體內抗體仍可以在一段時間內提供足夠的免疫力[8]。而體內抗體持續性決定二免間隔時間，為了使機體內的抗體水平迅速提高，則需要在最適時間進行二次免疫，從而提高免疫力。王麗[11]和顏靜蕊[13]的研究結果顯示，E.acervulina和E.necatrix的早熟株二免間隔為7～11 d時，雛雞能夠獲得足夠的保護力。本試驗選擇7～11 d為二免間隔來測定該疫苗的最小二免間隔，結果表明，所有組別均符合疫苗效力檢驗標準，也就說明雛雞在7～11 d的二免間隔時間內，均可獲得良好的免疫力。因此，7 d為本疫苗的最小二免間隔。

本疫苗按照最小免疫劑量和最小首免日齡來進行免疫，二免在第6～56天攻毒，結果顯示雛雞均產生了良好的免疫效果，所有觀測指標均符合疫苗效力檢驗標準。因此，本疫苗的免疫產生期為二免后的第6天，持續期至少可達到第56天，表明該疫苗可以保護商品白羽肉雞的整個生長期(45 d左右)。

試驗結果顯示，網上平養和地面平養對該球蟲疫苗免疫雛雞的生長性能的影響無顯著差異，對免疫效力也無顯著影響，證明雞球蟲病三價四株活疫苗可用于網上平養和地面平養2種飼養方式的雞群。