PRRSV/LPS共刺激抑制小鼠雌二醇分泌與苦參堿的改善作用

扆妍妍，裴亞萍，侯雅鑫，曹志剛，孫 娜，李宏全

(山西農業大學動物醫學學院，山西 太谷 030801)

感染性疾病常常擾亂雌性動物正常的卵巢周期活動，包括卵泡發育異常和卵巢囊腫，延長發情期和黃體期，造成生殖障礙。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的母豬繁殖障礙主要表現為妊娠母豬的流產、早產和死胎、弱胎、木乃伊胎等。研究報道，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)造成的生殖障礙極大可能是由于破壞生殖激素的平衡引起的[1]。臨床生產中，豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)多與其他豬病混合感染，引起或繼發一系列更復雜和嚴重的病理變化[2-3]。其中與豬圓環病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)共感染是導致母豬繁殖失敗的一個原因[4]。在大多數哺乳動物生產過程伴隨著大量細菌的感染，細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌壁的主要成分。LPS作用于下丘腦或垂體，抑制促性腺激素的釋放，或直接影響促卵泡激素受體(Follicle-stimulating hormone receptor，FSHR)和促黃體生成素受體(Luteinizing hormone receptor，LHR)蛋白的表達，從而影響動物生殖功能[5-6]。此外，LPS對卵巢有直接影響，包括卵泡成分，如卵泡膜和顆粒細胞或卵母細胞。研究報道，LPS可以引起雌激素的分泌紊亂[7-11]。本實驗室前期研究表明，與單獨感染相比，PRRSV 5′UTR RNA與LPS共刺激豬肺泡巨噬細胞可以加重炎癥反應[12]。雖然PRRSV不能感染小鼠，但是可以促進小鼠體內PCV2的復制[13]。PRRSV單獨作用小鼠，可以引起小鼠脾臟氧化應激，顯著增加促炎因子的表達[14]。但PRRSV與LPS共刺激小鼠是否影響雌激素分泌方面的研究目前仍有待進一步研究。

苦參堿(Matrine，MT)是存在于苦參、山豆、苦豆子等植物組織中的一種生物堿。本實驗室前期研究表明，苦參堿在體外可抑制PRRSV的復制[15-17]，改善PRRSV與PCV2共感染引起的間質性肺炎[13]，對LPS誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用[18]，并且抑制PRRSV 5′UTR RNA 與LPS共刺激誘導的炎癥發生[12]，顯著改善PRRSV和LPS共刺激誘導的小鼠間質性肺炎(數據未發表)。然而，苦參堿對雌激素的分泌是否有影響依然未知。因此，本試驗的目的是觀察LPS與PRRSV共刺激對小鼠體內雌二醇E2的影響并探討苦參堿可能發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與病毒 雌性昆明小鼠，(20±2) g,SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。PRRSV(JS-1)由江蘇省農業科學院饋贈，病毒TCID50為10-5.86。

1.2 試劑與儀器 主要試劑與藥物：苦參堿，購自南京澤朗有限公司，批號：ZL20171212SCZS，含量98.0%；LPS，購自北京索萊寶科技有限公司，批號：810P031；2×SYBR Green Low ROX qPCR Master Mix，購自上海Selleck-Bimake公司；TRIzol和PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，均購自大連TaKaRa公司；Mouse Estradiol(E2)Elisa Kit，購自上海Blue Gene，批號：20180706。主要儀器：離心機(Sigma，德國)；7500定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)；酶標儀(MD，美國)；ND-1000核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop，美國)。

1.3 試驗設計 將小鼠適應性飼養1周后，隨機分為3組，每組8只。空白對照組(Control)：腹腔注射等劑量生理鹽水；PRRSV/LPS共刺激組(PRRSV/LPS)：單次腹腔注射20 mg/(kg·bw) LPS和0.5 mL/只PRRSV(10倍稀釋)；苦參堿組(MT)：同PRRSV/LPS共刺激組，共刺激30 min后，腹腔注射40 mg/(kg·bw)苦參堿，連續注射3 次，每次間隔24 h，其他組注射等劑量生理鹽水。給藥7 d后收集血液，測定血清E2含量。凍存卵巢組織，保存于-80 ℃備用。

1.4 血清中E2的測定 小鼠眼眶采血，置于4 ℃至血清析出，3 000 r/min離心5 min，收集分裝血清，-80 ℃保存備用。使用ELISA法測定血清中E2含量。主要步驟為：取出酶標板，按照標準品順序依次加入空白微孔中；依次加入100 μL樣品，每個樣品重復3次，PBS為空白對照孔；各孔加入50 μL 酶標記液(不含空白對照孔)，37 ℃孵育1 h；洗滌液充分洗板5次，最后一次拍干殘留液體；各孔分別依次加入50 μL A液與50 μL B液，37 ℃避光反應15 min；加入50 μL終止液終止反應；使用酶標儀在450 nm處測定OD值。

1.5 實時熒光定量PCR 使用TRIzol法提取卵巢組織RNA，參照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser兩步法反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，qPCR檢測Star、3β-HSD、17β-HSD、CYP11a1、CYP19a1、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA相對表達量。根據NCBI上GenBank中公布的基因序列，利用Primer 5.0軟件設計用于實時熒光定量PCR的特異性引物，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 數據分析 試驗數據均使用GraphPad Prism 5軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)分析，數據均采用平均數±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 苦參堿對PRRSV/LPS引起的小鼠E2變化的影響 給藥7 d后采集血液，ELISA法檢測血清中E2含量的變化。如圖1所示，與空白對照組相比，PRRSV/LPS共刺激組E2含量顯著降低(P<0.05)，苦參堿作用后，E2含量顯著升高，恢復到正常水平(P<0.05)。此結果表明，PRRSV/LPS共刺激小鼠后可以引起小鼠血清中E2含量的降低，而苦參堿對PRRSV/LPS誘導的E2降低具有保護作用。

圖1 苦參堿對小鼠血清中E2的影響Fig.1 Effect of matrine on serum E2 in mice注:不同字母表示差異顯著，P<0.05，相同字母表示差異不顯著，P>0.05；下圖同Note:The difference letters indicate significant differences,P<0.05,the same letters mean not significant difference,P>0.05.The same as below

2.2 苦參堿對PRRSV/LPS誘導的小鼠E2合成相關基因變化的影響 qRT-PCR檢測小鼠E2合成過程中相關基因的表達。由圖2可知，與空白對照組相比，PRRSV/LPS共刺激組顯著降低StaR、CYP11a1、CYP19a1 mRNA的表達(P<0.05)，苦參堿處理組顯著升高CYP11a1 mRNA的表達(P<0.05)，對PRRSV/LPS共刺激造成的StaR、CYP19a1表達降低沒有改善作用，3β-HSD和17β-HSDmRNA在各處理組間差異不顯著(P>0.05)。表明PRRSV/LPS可能是通過改變E2合成過程中相關酶影響E2的分泌，苦參堿發揮保護作用也是因為對相關酶產生影響引起的。

圖2 苦參堿對小鼠E2合成相關基因變化的影響Fig.2 Effect of matrine on the changes of E2 synthesis related genes in mice

2.3 苦參堿對小鼠卵巢凋亡相關基因的影響 qRT-PCR檢測給藥7 d后卵巢凋亡相關基因的表達，結果如圖3所示，各組之間Caspase-3、Bcl-2/BaxmRNA表達均無顯著差異(P>0.05)。提示PRRSV/LPS共刺激引起的E2變化不是通過細胞凋亡引起的，苦參堿不通過此途徑發揮保護作用。

圖3 苦參堿對小鼠卵巢凋亡相關基因變化的影響Fig.3 Effect of matrine on the changes of ovarian apoptosis related genes in mice

3 討論

PRRSV可以引起妊娠母豬的流產、死胎、木乃伊胎等，同時可能繼發細菌感染。PRRSV單獨作用小鼠時，能引起氧化應激與炎癥反應[14]。PRRSV與PCV2共同作用小鼠時，促進PCV2的復制，并誘發更為嚴重的肺臟病變[13]。PRRSV 5′UTR RNA與LPS共刺激豬肺泡巨噬細胞，促進炎癥因子的表達[12]。同時大量研究報道，LPS對雌性類固醇激素分泌有重要影響，進而影響生殖功能。但PRRSV與LPS共刺激對小鼠E2分泌的影響尚不清楚。因此本試驗通過使用PRRSV/LPS共同刺激小鼠，ELISA法檢測小鼠血清中E2含量。結果發現,PRRSV/LPS共刺激后顯著抑制了小鼠E2的分泌。大量研究表明，苦參堿具有抗炎、抗病毒作用[12-13,16-18]，但是對雌激素分泌的影響尚不清楚。因此本試驗探究了苦參堿對PRRSV/LPS共刺激誘導的血清E2分泌降低是否有保護作用，結果顯示，給藥7 d后苦參堿顯著抑制PRRSV/LPS誘導的E2降低，表明苦參堿對于PRRSV/LPS引起的E2降低具有改善作用。

卵巢類固醇激素主要由卵泡膜細胞和顆粒細胞合成，包括孕激素、雄激素和雌激素，在卵泡發育和排卵過程中起關鍵作用。類固醇激素生成酶和卵泡膜細胞、顆粒細胞對E2合成至關重要。膽固醇首先被類固醇生成急性調節蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StaR)從線粒體外膜轉運至內膜，在CYP11a1基因編碼的細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶(Lesterol side-chaincleavage cvtochrome P450，P450 scc)催化下合成孕烯醇酮，隨后被3β-羥類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)代謝為孕酮。孕酮在細胞色素P450 17a-羥化酶(17a-hydroxylage cytochrome P450，P450c17)的催化下轉化成雄激素。CYP19a1基因編碼的細胞色素P450芳香化酶(P450arom)和17β-羥類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD)催化雄烯二酮或睪酮合成雌二醇。在此過程中，StaR被認為類固醇激素合成過程中的第1個限速酶。P450arom是雌激素生成的限速酶，P450arom的激活是通過促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)與顆粒細胞上FSH受體結合引起的。此外，雌激素與其合成相關酶、其他激素之間存在負反饋調節。在本試驗中PRRSV/LPS共刺激降低E2的分泌，但對于其作用機制并不清楚。因此通過檢測類固醇合成相關基因探究其可能的機制，結果發現PRRSV/LPS顯著降低StaR、CYP11a1、CYP19a1 mRNA 的表達。表明PRRSV/LPS可能是通過影響其合成過程關鍵酶的基因表達來降低E2的分泌。小鼠腹腔注射苦參堿后卵巢組織CYP11a1 mRNA的表達量顯著升高，StaR、3β-HSD、17β-HSDmRNA有升高的趨勢，但是差異不顯著。因此，本試驗結果證明苦參堿可以通過調節雌激素合成過程中相關酶發揮改善作用。苦參堿可能是直接影響酶的合成發揮作用，也可能是影響類固醇激素合成的上游信號通路如cAMP/PKA發揮作用，其具體機制仍有待進一步研究。此外，我們探究了PRRSV/LPS誘導的E2分泌降低是否與卵泡細胞凋亡有關，通過檢測凋亡相關基因(Caspase-3、Bcl-2、Bax)的mRNA表達發現，PRRSV/LPS誘導E2的分泌降低以及苦參堿的改善作用并不通過細胞凋亡發揮作用。

綜上所述，PRRSV/LPS共刺激可以降低小鼠血清中E2的分泌，主要是通過影響雌激素合成過程中編碼StaR、P450 scc和P450arom的基因表達來發揮作用。而苦參堿可以通過影響編碼P450 scc的基因發揮改善作用。