青島地區犬流感的流行病學調查及H3N2亞型流感病毒的分離鑒定

劉佳卉，馬清霞，楊海燕，李軍偉，單 虎，張傳美

(青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)屬于正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒，主要引起犬的呼吸系統疾病，表現為發燒、流鼻液、食欲不振、精神沉郁等。近年來發生了多種亞型的流感病毒感染犬的事件：2004年，美國首次發生H3N8馬流感病毒跨種族傳播感染賽犬，表現出明顯的臨床癥狀并導致賽犬死亡[1]；2007年，韓國首次發現犬感染禽源H3N2流感病毒[2]；我國于2006—2010年分離了多株H3N2亞型犬流感[3-4]；2009年，我國發現犬感染H1N1亞型流感病毒，與當時流行的人甲型H1N1流感病毒高度同源[5]；2015年，H3N2亞型犬流感病毒從亞洲傳播到了美國[6]，隨后在多個地區均出現報道；我國自2016年以來H3N2亞型犬流感流行毒株的抗原性發生了很大變化，取代了之前的流行毒株[7]；2017—2018年，在加拿大發生多起H3N2亞型犬流感疫情，出現104例確診病例，作者認為從亞洲進口的犬只是感染源[8]。

犬作為重要的伴侶動物，與人類接觸密切，并且可以感染多種流感病毒[9]，其在流感病毒跨物種傳播過程中有重要的公共衛生學意義。為了解當前青島地區CIV的流行情況，本研究對青島及周邊地區犬進行血清學調查，分離得到1株H3N2亞型流感病毒，對其遺傳進化特性進行了分析，為青島地區犬流感的疫情監控和病毒進化情況提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品和SPF雞胚、小鼠 2017年11月—2018年4月采集了青島地區犬只繁育場、流浪犬基地以及動物醫院的134份犬血清、120份犬的鼻咽拭子樣品。9日齡SPF雞胚，購自濟南斯派福瑞禽業科技有限公司；8周齡雌性BALB/c小鼠，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 主要試劑 受體破壞酶(RDE)，購自日本Denka Seiken公司；H5、H7、H9亞型血凝抑制抗原與陽性血清，均購自哈爾濱維科生物技術開發公司；H1、H3亞型血凝抑制抗原與陽性血清為本實驗室保存。AIV熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自QIAGEN公司；高保真酶、T載體試劑盒，均購自北京擎科新業生物技術有限公司；核酸提取試劑盒、反轉錄酶、膠回收試劑盒和E.coliDH5α，均購自TaKaRa公司。

1.3 血清抗體的檢測 為調查青島地區犬只中各種亞型流感病毒的感染情況，參照國標方法(GB/T 18936-2003)進行血凝抑制(HI)試驗，檢測采集血清中H1、H3、H5、H7和H9亞型流感病毒的抗體。按照說明書操作處理血清：將1體積犬血清加3體積受體破壞酶(RDE)37 ℃處理過夜(18～20 h)后，56 ℃水浴滅活1 h，加6體積生理鹽水，即為10%待測血清樣品。HI滴度大于20即為抗體陽性。

1.4 引物合成 比較GenBank中多個H3N2亞型CIV基因序列，由青島擎科梓熙生物技術有限公司合成8對基因片段的引物(如表1)。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 病毒的分離鑒定 采集犬鼻咽拭子，接種于9日齡SPF雞胚，收取接種雞胚的尿囊液進行血凝試驗(HA)測其血凝價，HA陽性的尿囊液提取核酸，參照試劑盒說明書進行熒光RT-PCR檢測AIV病毒。

1.6 全基因組序列測定及分析 病毒尿囊液提取核酸經反轉錄制備cDNA，采用流感病毒各片段特異性引物分別擴增8個片段，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段產物，克隆于T載體，由青島擎科梓熙生物技術有限公司進行序列測定。分別將測序結果導入NCBI網站，在線BLAST比對各基因片段的同源序列。從GenBank中下載犬H3N2流感病毒參考序列，應用 MEGA7軟件進行遺傳進化分析，使用Neighbor-Joining方法基于遺傳距離構建系統發育進化樹，Bootstrap值為1 000。

1.7 雞胚半數感染量(EID50)測定 將病毒尿囊液用進行10倍系列稀釋，每個稀釋度接種5枚9～10日齡的SPF雞胚，0.2 mL/胚，37 ℃孵化，每12 h觀察雞胚的死亡情況，記錄雞胚的死亡時間。連續觀察至120 h，將存活的雞胚在4 ℃冷凍致死后，收集所有雞胚的尿囊液，用血凝試驗測定雞胚的感染情況，參照 Reed and Muench的方法[10]計算病毒的EID50。

1.8 小鼠致病性試驗 將24只6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為試驗組和對照組，其中試驗組18只，對照組為6只，隔離飼養。將小鼠用乙醚輕微麻醉，試驗組小鼠經鼻腔途徑接種病毒的雞胚尿囊液50 μL，對照組按相同方法和劑量接種無毒SPF雞胚尿囊液作對照。攻毒后每日觀察小鼠的臨床表現，固定時間測量體溫與體重，記錄其采食量與飲水量。持續觀察14 d。第3、5、7、9、11天和第14 天分別剖殺3只小鼠，觀察各組織病理變化；無菌采集肺組織，用于病毒的熒光定量PCR測定。

2 結果

2.1 血清流行病學調查 HI試驗結果顯示，所有被檢血清樣品中8.2%(11/134) 對H1亞型流感抗原呈陽性反應，7.5%(10/134)對H3亞型流感抗原呈陽性反應，0.7%(1/134)對H5亞型流感抗原呈陽性反應，沒有樣品對H7亞型流感抗原呈陽性反應，4.7%(6/134)對H9亞型流感抗原呈陽性反應。如表2。

表2 犬血清中抗體檢出情況Table 2 Detection of antibodies in canine serum

2.2 病毒的分離鑒定 從1例有呼吸道癥狀的患犬鼻咽拭子中分離得到1株流感病毒，命名為A/Canine/Qingdao/0309/2018/H3N2。熒光定量RT-PCR結果顯示，有特異性擴增曲線，Ct值為21.668。測得該病毒的雞胚半數感染量(EID50)為10-4.75/0.2 mL。

2.3 全基因序列分析 對病毒的8個基因片段分別擴增，電泳檢測可見擴增得到了與預期大小相符的目的條帶，如圖1。BLAST及遺傳進化分析結果顯示，該毒株并未發生重組，8個片段的核苷酸序列均與2017年國外流行毒株的同源性較高，比對同源性最高的序列均為A/Canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)。

圖1 病毒8個基因片段的RT-PCR擴增產物Fig.1 RT-PCR amplification products of 8 gene fragments of virusM：DL-2 000 DNA marker；1：HA基因；2：NA基因；3：PB2基因；4：NS基因；5：PA基因；6：NP基因；7：PB1基因；8：M基因；9：陰性對照M:DL-2 000 DNA marker;1:HA gene;2:NA gene;3:PB2 gene;4:NS gene;5:PA gene;6:NP gene;7:PB1 gene;8:M gene;9:Negative control

2.3.1HA基因序列分析 該株病毒HA基因由1 701個 核苷酸組成，編碼566個氨基酸。HA基因裂解位點(340～348)氨基酸序列為PERQTRGLF，僅含有2個堿性氨基酸，符合低致病性禽流感的特征。共有6個潛在糖基化位點，分別為38 NGT、54 NAT、61 NSS、97 NET、181 NVT、499 NGT。該分離株受體結合位點226位氨基酸是Q，具有與α,2-3和α,2-6唾液酸受體結合的特性。由繪制的系統進化樹(如圖2)可以看出，該毒株與近年在美國等地流行的H3N2亞型CIV的親緣關系較近，而與中國、韓國等地的流行毒株相對較遠，這表明近幾年在中國H3N2亞型CIV在流行過程中HA基因發生了很大的變異。

圖2 HA基因的遺傳進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the HA gene▲：本分離株▲:The isolated strain

2.3.2NA基因序列分析 該株病毒的NA基因有7個潛在的糖基化位點：61 NIT、70 NTT、86 NWS、146 NST、200 NAT、234 NGT、402 NWS，NA基因上與神經氨酸酶抑制劑耐藥性相關的位點均沒有發生突變，因此推測這株病毒對神經氨酸酶抑制劑敏感。遺傳進化分析結果表明，該毒株與2016—2017年美國各州分離株的同源關系較近(見圖3)。

圖3 NA基因的遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of the NA gene▲:本分離株▲:The isolated strain

2.4 小鼠致病性試驗 攻毒小鼠第2天即開始出現采食量下降，體溫降低，精神沉郁，聚堆現象，體重下降明顯。持續到第5天體溫、體重開始回升，至第10天基本恢復正常。攻毒期間發病小鼠未出現死亡，對照組小鼠未出現任何臨床癥狀，體重與體溫均正常。攻毒組與對照組體溫與體重的變化情況見圖4。

圖4 感染后小鼠體溫、體重變化Fig.4 The changes of body temperature and body weight of infected miceA：小鼠體溫變化；B：小鼠體重變化A：Changes of body temperature in mice;B：Changes of body weight in mice

剖檢攻毒小鼠見肺部水腫、淤血和出血，體積增大；支氣管內有血色泡沫狀液體。心、肝、脾、腦和腎臟未見明顯的眼觀變化。對照組小鼠各臟器未見明顯異常。

肺組織中病毒含量的熒光定量RT-PCR檢測結果顯示，攻毒后第3天小鼠肺臟可以檢測到病毒，持續到第7天，第9天未檢測到病毒。

3 討論

目前已有報道犬感染H1N1[5]、H3N8[1]、H3N2[2-4,6-8]、H5N2[11]、H9N2[12]等多種亞型流感病毒[9,13]。研究發現[14-15]，禽型和人型流感病毒受體Sia α2-3Gal和Sia α2-6Gal廣泛分布于犬的各個組織器官,犬具備同時感染禽型和人型流感病毒的分子基礎，這提示我們犬可能成為不同流感病毒的潛在靶細胞，使得流感病毒在其體內重組從而產生新的病毒。通過對青島地區犬流感的流行病學調查發現，青島地區部分犬只的血清中含有H1、H3、H5、H9亞型流感病毒抗體，說明有上述病毒的暴露風險。H1和H3亞型流感病毒在犬中的感染和傳播情況已有大量報道[4-8,16-17]，但H5和H9亞型的報道相對較少。在134份犬血清中僅檢測到1份H5陽性和6份H9陽性的血清，回顧發現這些血清檢測陽性的犬均采集自青島市的寵物市場。在調查過程中發現，寵物市場的犬只來源于不同的犬舍，市場上還有各種鳥獸被飼養在一起待售，這些犬只可能在犬舍中感染，也可能在市場上與其他鳥獸混養導致感染流感病毒，有待于進一步調查。不同亞型的流感病毒在犬只之間流行，增加了流感病毒發生重組的風險，因此進一步加強犬流感病毒的監測對犬類健康和人類公共衛生具有重要意義。

H3N2亞型犬流感最初源自水禽中的禽流感病毒，近年來，H3N2亞型犬流感病毒在中國、韓國、加拿大和美國等地犬群中廣泛流行，且不斷發生變異[4,6-8]。呂艷麗等研究發現，自2016年以來，具有新型遺傳進化和抗原性的H3N2亞型犬流感病毒已在中國某些地區的犬中流行，已經取代了之前的流行毒株[7]。遺傳進化分析發現，本研究中分離得到的這株H3N2亞型流感病毒與2017年北京和美國分離株的親緣關系較近，這與之前的研究一致，而與2015年以前我國和韓國的分離株的親緣關系則較遠，屬于2016年以后國內流行的H3N2的新型毒株。

小鼠致病性試驗表明，該分離株可以感染BALB/c小鼠，體溫、體重均下降，但不致死，屬低致病力的毒株。流感病毒感染小鼠后會導致小鼠體溫下降，引起肺炎的癥狀。該分離株的8個基因片段目前均未出現重組，但仍需警惕該病毒長期在犬群流行的過程中可能與人類季節性流感病毒發生重組，從而獲得感染人的能力，可能會對人類健康產生較大的潛在威脅，應當引起人們的廣泛關注。