HPLC-MS/MS法同時測定保健食品中11種壯陽類非法添加

朱燕燕，馬桂娟，龔慧

寧夏回族自治區食品檢測研究院（銀川 750001）

近年來，補腎壯陽及緩解疲勞類保健食品中非法添加5型磷酸二酯酶抑制劑（Phosphodiesterase-5，PDE-5）現象時有發生。PDE-5中僅有西地那非、他達拉非、伐地那非批準上市，均為處方類藥物，是臨床上治療男性勃起障礙的常用藥[1]。臨床上，PDE-5有嚴格的服用限量要求，消費者長期服用這些違禁保健食品，對人體健康造成嚴重威脅。

目前，PDE-5在保健食品中的檢測手段主要有理化鑒別法、免疫法、近紅外光譜法、薄層色譜法、顯微共聚焦拉曼光譜法、高效液相色譜法[2-8]。理化鑒別法、免疫法、近紅外光譜法、薄層色譜法、顯微共聚焦拉曼光譜法及高效液相色譜法預處理比較簡單，但其靈敏度低，選擇性差，可能會造成假陽性。HPLCMS/MS法具有靈敏度高、準確度高等優點，成為保健食品等基質復雜樣品的痕量物質確證的首選方法。國家食品藥品監督管理局制定相關標準指導此類物質的檢測[9]，但檢測保健食品時應用該方法存在線性不好、回收率不高等情況，并且隨著檢測手段和儀器的不斷發展，標準中的一些儀器參數及操作步驟需要進一步優化。試驗旨在優化HPLC-MS/MS法同時檢測11種壯陽類非法添加藥物的方法并做出方法學的論證，為標準修訂及有效監控保健食品中非法添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保健食品（市售）。

11種那非類標準品（伐地那非、那紅地那非、紅地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非對照品，德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度＞99%）；甲醇、乙腈（色譜純，Thermo Fisher公司）；甲酸（色譜純，德國Sigma公司）；超純水（美國Milli-Q超純水系統純化）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀（6410，美國Agilent公司，配有AJS ESI離子源及Mass Hunter數據處理系統）；超聲機（B2200S-7，上海必能信超聲有限公司）；氮吹儀（EVA50A，北京普利泰科有限公司）；分析天平（BT25S，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millinpore公司）。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流速0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μ L；運行時間20 min；流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.3.2 質譜條件

離子源，電噴霧離子源；掃描模式，正離子掃描；反應方式，MRM（多反應監測）模式；鞘氣溫度350 ℃，流速10.0 L/min；霧化器壓力40 psi；毛細管電壓4 kV，具體參數詳見表2。

表2 11種壯陽類物質的質譜優化參數

1.4 試驗步驟

1.4.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取11種那非對照品，各10 mg左右，置于10 mL容量瓶中，用乙腈制成約1.0 mg/mL的單標溶液。分別精密量取1.0 mL 11種標準溶液，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋成10.0 μg/mL的混合標準儲備液。同法將混合標準儲備液分別稀釋至0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.500，1.000和2.000 μg/mL的標準工作溶液。

1.4.2 樣品前處理

稱取2.0 g（精確至0.02 g）樣品于50 mL容量瓶中，加入30 mL乙腈后超聲10 min，冷卻至室溫，用乙腈定容至刻度。用移液管準確移取2.0 mL定容液于試管中，40 ℃氮吹至干，用初始流動相（0.1%甲酸水溶液與0.1%甲酸乙腈溶液體積比80∶20）定容至2.0 mL，渦旋混勻，經0.22 μ m水相濾膜過濾，上機待測。

1.4.3 標準曲線的制作

分別準確移取0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.500，1.000和2.000 μg/mL的標準工作溶液各100 μ L，準確移取空白基質提取液各900 μL稀釋成濃度為1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0和200.0 ng/mL的系列標準工作溶液。上機測定，記錄數據，制作標準曲線。

1.4.4 加標回收率試驗及精密度試驗

按照1.4.2的方法制備3份樣品溶液，分別向其中加入200 μ L 10.0 μ g/mL混合標準工作溶液、200和400 μ L 1.0 μ g/mL混合標準工作溶液，分別同時制備10組平行樣，其余步驟同上，記錄數據，計算回收率及RSD。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

由于11種那非的分子結構中均含有氨基，因此均采用正離子模式對其進行電離。分別對濃度為1.0 μg/mL的各目標化合物進行單針進樣，對其質譜條件進行優化。當目標化合物進入一級質譜后，可以產生穩定的[M+H]+準分子離子峰。對準分子離子峰進行二級質譜分析，得到子離子的質量數，在MRM（多反應監測）模式下優化碰撞能等參數，使得子離子達到最佳響應。為11種那非類分別選取質譜響應最佳的2對MRM離子對及相應的參數作為最終質譜采集參數，詳見表2。采集得到的MRM色譜圖見圖1。

圖1 11種那非類標準品的MRM色譜圖

2.2 基質效應

基質效應是在提取基質中的目標組分時，基質中的干擾物影響目標組分的離子化，使得目標組分在儀器上的響應發生增強或者抑制效應的現象[10]，影響分析結果的準確性。考察的11種那非類化合物在保健品中均有基質抑制效應。為提高目標化合物測量的準確度，該方法使用空白基質提取液配制標準曲線，降低基質干擾的影響。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

將系列基質標準工作溶液分別進行測定，以質量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，11種那非在1.0～200.0 ng/mL的范圍內，其濃度與各待測物的峰面積呈良好的線性關系。11種添加物的線性回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限（信噪比S/N≥3）見表3。

表3 11種那非類物質的線性回歸方程，相關系數，線性范圍和檢出限

2.4 方法的準確度和精密度

由不含目標組分的保健品作為空白樣品進行3個水平的加標回收率試驗，加標濃度水平分別為0.1，0.2和1.0 mg/kg，其中伐地那非的回收率范圍為72.6%～108.6%，紅地那非的回收率范圍為86.5%～120.7%，那紅地那非的回收率范圍為83.7%～116.5%，豪莫西地那非的回收率范圍為77.6%～116.4%，枸櫞酸羥基豪莫西地那非的回收率范圍為85.4%～116.4%，西地那非的回收率范圍為82.3%～114.7%，氨基他達拉非的回收率范圍為86.5%～111.5%，硫代艾地那非的回收率范圍為62.5%～79.4%，他達拉非的回收率范圍為83.2%～120.1%，偽伐地那非的回收率范圍為82.1%～106.3%，那莫西地那非的回收率范圍為85.5%～108.2%。其相對標準偏差范圍為4.2%～9.5%，其精密度符合方法學要求。11種那非類的回收率及相對標準偏差的數據見表4。

表4 11種那非類回收率及精密度試驗

2.5 色譜條件的優化

11種那非在不同的流動相中分離程度不同，對比三種流動相甲醇-乙酸銨溶液，乙腈-乙酸銨溶液，甲酸乙腈-甲酸水溶液。通過試驗，各待測物在甲酸乙腈-甲酸水溶液流動相中的分離度及峰型良好。因此，選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相；在Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱，通過梯度洗脫對11種添加物進行分離，目標化合物的保留時間在5～15 min之間。

2.6 樣品測定

采用該方法對市售保健品進行測定，隨機采購50個批次市售保健酒及功能性飲料，其中49個批次未檢測出，1個批次的人參酒中檢測出西地那非，樣品譜圖見圖2。

圖2 人參酒樣品的色譜圖

3 結論

采用乙腈直接提取，同時測定保健食品中11種那非的含量。該法簡單、可靠、重現性好、靈敏度高，適用于保健品基質樣品中11種壯陽類物質的同時檢測。