GO/HF-SPME-HPLC-MS/MS測定牛奶中7種糖皮質(zhì)激素

余鵬飛，倪娟楨，趙月鈞，陳可，董葉箐，何曉明

綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司（杭州 310052）

糖皮質(zhì)激素，是一種腎上腺分泌的類固醇激素，具有抗炎、抗過敏、抗休克和抗免疫抑制等作用，還可用作動物的生長促進劑，加快動物生長，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1-2]。然而有研究表明，過量使用會導(dǎo)致動物源性食品中藥物殘留，對人類健康產(chǎn)生危害[3]。農(nóng)業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[4]對牛奶中部分糖皮質(zhì)激素類藥物的檢出和最高限量值做出明確規(guī)定：地塞米松0.3 μg/kg，氫化可的松不得檢出。

糖皮質(zhì)激素的檢測方法主要包括氣相色譜-質(zhì)譜法（GC）[5]、液相色譜法（LC）[6-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[8-11]，其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其特異性強、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，為獸藥檢測首選方法。由于糖皮質(zhì)激素在牛奶中通常以痕量存在，在進行檢測分析前需進行濃縮、富集和凈化等步驟，現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)與文獻報道多采用固相萃取[8,12]、液液萃取[9]、基質(zhì)固相分散萃取[10-11]等對樣品進行前處理，這些方法的有機溶劑用量大、操作步驟繁瑣復(fù)雜、耗時較長，不能滿大批量快速檢測樣品的要求。因此，建立一種簡單、快速、靈敏的前處理方法用于篩查牛奶中糖皮質(zhì)激素殘留尤為重要。

中空纖維微萃取（HF-SPME）是一種利用中空纖維的微孔孔徑較小限制樣品溶液中的大分子物質(zhì)進入萃取相，集萃取和凈化一步完成的樣品預(yù)處理技術(shù)。在環(huán)境、生物樣品痕量分析中有良好使用[13-15]。但是，中空纖維中作為受體相的有機溶劑存在容易在萃取過程中溶于樣品溶液的情況，降低萃取效率。

氧化石墨烯是近年來興起的一種新型納米材料，具有超大的比表面積及豐富的含氧官能團，可與有機化合物形成π-π相互作用，被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理研究[16-17]。近年來，有研究者將中空纖維和氧化石墨烯2種材料獨特的優(yōu)點相結(jié)合，制備氧化石墨烯/中空纖維復(fù)合材料用于樣品前處理過程并取得良好的應(yīng)用效果[18-19]。

該方法采用中空纖維/氧化石墨烯用于樣品前處理，并與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合建立同時測定牛奶中7種糖皮質(zhì)激素的分析方法。該方法簡單高效，同時靈敏度也能滿足日常檢測需求，適合于實驗室大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品：倍氯米松、地塞米松、甲基潑尼松龍、氟氫可的松、氫化可的松、可的松、潑尼松龍（德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度≥95%）；氘代氫化可的松內(nèi)標(biāo)物（加拿大CDN公司，純度≥99%）。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四級桿液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS 8050，日本Shimadzu公司）；多管渦旋混合儀（DMT-2500，杭州米歐儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水機（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 氧化石墨烯/中空纖維制備

將中空纖維膜剪成長度約2 cm小段，用丙酮超聲清洗10 min，取出晾干。取50 mg氧化石墨烯分散于100 mL N, N-二甲基甲酰胺中，超聲分散2 h，制備成500 mg/L氧化石墨烯溶液。將晾干的中空纖維浸入500 mg/L氧化石墨烯溶液中超聲2 h，使氧化石墨烯完全固定在中空纖維膜的微孔中，取出用去離子水洗滌數(shù)次，除去中空纖維表面及內(nèi)部多余的氧化石墨烯，晾干備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置于-18 ℃冰箱保存。使用時，用甲醇稀釋成各種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，備用。

1.3.3 樣品前處理

在多少個寒冷的、屋頂漏水的晚上，易非徹夜不眠，她睜著眼睛盯著屋頂，腦海里一遍又一遍地重復(fù)這句話：我是爸爸的親女兒呢，能不像爸爸嗎？易非覺得爸爸一直在黑暗中陪著她，甚至不時用他那有著淡淡煙草味道的雙手撫摸著她的頭。只有爸爸仍然把她當(dāng)一個孩子來看待。

稱取5 g樣品于10 mL離心管中，加入50 μL 500 μg/L氘代氫化可的松同位素工作液，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)至pH 10，將處理好的氧化石墨烯/中空纖維放入離心管中，超聲萃取10 min。取出氧化石墨烯/中空纖維，濾紙擦干后放入裝有1 mL甲醇的小瓶中，超聲解析3 min，經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾后待測。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；進樣量3 μ L；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸-2 mmol/L水溶液，B為乙腈溶液；流速0.15 mL/min；采用梯度洗脫的分離程序，洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～40% B；1.5～2.5 min，40%～90% B；2.5～5 min，90% B；4～5 min，65%～90%B；5～6 min，90%～10% B。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）：負(fù)離子模式；加熱塊溫度400 ℃，毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化氣流量3.0 L/min；加熱氣流量10.0 L/min；定性與定量離子對、碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 7種糖皮質(zhì)激素及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品量的優(yōu)化

由于糖皮質(zhì)激素類藥物在牛奶中以痕量存在，加大樣品的稱樣量，增加富集倍數(shù)，是提高實際檢測濃度的有效手段之一。考察樣品1～10 g時對萃取效率的影響。結(jié)果表明（見圖1），樣品量增加到5 g時，萃取效率沒有明顯變化，繼續(xù)增加樣品量，萃取效率逐漸減少。這可能是樣品量5 g時剛好達到吸附平衡，樣品量繼續(xù)增大，僅用2 cm的氧化石墨烯/中空纖維和10 min的萃取時間無法充分吸附目標(biāo)化合物，致使萃取效率降低。因此，選擇樣品量為5 g。

圖1 樣品量對萃取效率的影響

2.1.2 樣品溶液pH的優(yōu)化

樣品溶液pH不僅能改變目標(biāo)化合物的存在形態(tài)，也會改變吸附材料表面電荷和密度，是影響萃取效率的重要因素。考察pH 4～14的萃取效率。結(jié)果表明（見圖2），pH 4～10時，隨著pH增加，萃取效率明顯增大。這是由于目標(biāo)化合物為堿性化合物，在堿性環(huán)境中呈分子狀態(tài)，隨著pH增大，與氧化石墨烯之間的疏水作用力增強，萃取效率增大；之后隨著pH增大，萃取效率略有下降，這可能是氧化石墨烯絮凝沉淀的關(guān)系。因此，試驗選擇最佳pH 10。

圖2 樣品溶液pH對萃取效率的影響

2.1.3 萃取條件的優(yōu)化

試驗比較超聲萃取和振蕩萃取2種萃取方式對7種糖皮質(zhì)激素類萃取效率的影響。結(jié)果表明（見圖3），在相同時間下，超聲萃取的萃取效率明顯好于渦旋萃取。這是因為渦旋萃取時容易產(chǎn)生氣泡附在中空纖維膜的外壁，影響目標(biāo)化合物的萃取，而超聲萃取時超聲波輻射產(chǎn)生的強烈空化效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)可以加強傳質(zhì)過程，從而提高萃取效率。

圖3 萃取方式萃取效率的影響

進一步考察萃取時間（4～14 min）對萃取效率的影響。結(jié)果表明（見圖4），萃取時間10 min時萃取效率最好，萃取時間繼續(xù)增加，解析效率略有下降，可能是過長的超聲時間使氧化石墨烯從中空纖維壁上脫落。因此，試驗選擇萃取方式為超聲萃取10 min。

圖4 萃取時間對萃取效率的影響

2.1.4 離子強度的優(yōu)化

在水溶液中加入適量的鹽可以增加離子強度，減少目標(biāo)化合物在樣品中的溶解度，有助于提高萃取效率。通過在樣品溶液中加入不同濃度NaCl（0～20%），考察離子強度對目標(biāo)化合物萃取效率的影響。結(jié)果顯示，在其他條件不變時，額外添加NaCl對目標(biāo)化合物的萃取效率無顯著影響。因此，試驗選擇不加NaCl。

2.1.5 解析條件的優(yōu)化

萃取完成后，為了將目標(biāo)化合物從氧化石墨烯/中空纖維上盡可能完全地解析，試驗考察甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇4種解析溶劑的解析效率。結(jié)果表明（見圖5），甲醇的解析效率最好。

進一步考察解析溶劑用量為0.5～3 mL時對于解析效率的影響。結(jié)果表明，隨解析溶劑用量增加，解析效率逐漸變大，解析溶劑用量1 mL時，解析效率達到最大；繼續(xù)增加解析溶劑用量，解析效率基本不變。

考察解析時間在1～5 min范圍內(nèi)對萃取效果的影響。結(jié)果表明，解析時間在1～3 min時，隨著時間增加，解析效率逐漸提高；超過3 min后解析效率趨于平穩(wěn)，說明3 min時基本能達到解析完全。因此，試驗采用1 mL甲醇作為解析溶劑，解析時間3 min作為最佳解析條件。

圖5 解析溶劑對萃取效率的影響

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜分析中普遍存在，共流出干擾物對目標(biāo)物離子造成的離子抑制或增強效應(yīng)，可能嚴(yán)重影響定量的準(zhǔn)確性。試驗采用提取后添加法，測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛饶繕?biāo)化合物的離子響應(yīng)強度，通過二者比值來評價基質(zhì)效應(yīng)（ME）。如式（1）所示。結(jié)果表明（見表2），除氟氫可的松外，其余6種目標(biāo)化合物基質(zhì)效應(yīng)影響不大，說明中空纖維的微孔結(jié)構(gòu)有效限制牛奶中的蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)進入，具有減弱基質(zhì)干擾的能力。試驗參照GB/T 21981—2008[12]采用氘代氫化可的松同位素內(nèi)標(biāo)校正，因此無須使用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行測定，從而提高該方法在日常檢測效率。

式中：A和B分別為純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中目標(biāo)化合物的峰面積。若ME＜0.8，說明基質(zhì)對目標(biāo)化合物產(chǎn)生較強的抑制作用；ME＞1.2，則說明基質(zhì)增強效應(yīng)；0.8＜ME＜1.2表明基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限及定量限

配制6點不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液中7種糖皮質(zhì)激素質(zhì)量濃度分別為1，5，10，25，50和100 μg/L，氫化可的松同位素的質(zhì)量濃度均為25 μg/L，以濃度（X，μg/L）為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表2可以看出，7種目標(biāo)化合物線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)不低于0.99。根據(jù)檢出限大于等于3倍信噪比，定量限大于等于10倍信噪比的計算方法，得出7種糖皮質(zhì)激素的方法檢出限為0.04～0.09 μ g/kg，定量限為0.12～0.30 μ g/kg。

表2 7種糖皮質(zhì)激素的線性方程、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.3.2 加標(biāo)回收試驗

在空白牛奶樣品中分別添加3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平平行測試6次，計算其平均回收率。結(jié)果表明，7種糖皮質(zhì)激素的平均加標(biāo)回收率范圍為72.9%～89.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%～9.5%，符合獸藥殘留測定的要求。

表3 空白牛奶中7種糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 實際樣品的測試

采用該方法對市售的10種不同品牌的牛奶中糖皮質(zhì)激素殘留量進行檢測，均未檢出7種糖皮質(zhì)激素。

3 結(jié)論

基于自制的氧化石墨烯/中空纖維的固相微萃取技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立測定牛奶中7種糖皮質(zhì)激素的方法，對影響萃取效率的條件，如樣品體積、樣品溶液pH、萃取條件、離子強度、解析條件進行優(yōu)化。該方法操作簡單、快速，精密度和重現(xiàn)性較好，可應(yīng)用于牛奶中糖皮質(zhì)激素的快速篩查。