黑果枸杞中原花青素的提取及其咀嚼片的研制

于培良，田可，王倩倩，張俊瑤，趙立春*，裴棟

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（南寧 530001）；2. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（蘭州 730000）；3. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（濟(jì)寧 272013）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬灌木，生長于中國的青海、甘肅、寧夏、新疆、內(nèi)蒙古及國外的南美洲，歐亞大陸溫帶地區(qū)[1]。最早在藏醫(yī)中有入藥的記載，藏醫(yī)稱為“旁瑪”，味甘、性平，用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥[2]。民間常生食或榨汁做飲料，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、明目及降壓作用[3]。現(xiàn)代研究表明，黑果枸杞含有豐富的礦物質(zhì)元素[4]、維生素[5]、氨基酸等營養(yǎng)成分，以及較高的原花青素[6]、花色苷[7]、多酚[8]、多糖[9]、甜菜堿[10]等功效成分，素有“軟黃金”之稱[11]。其中原花青素是黑果枸杞的主要功效成分之一[6]，根據(jù)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，原花青素具有抗衰老、抗腫瘤、抗癌變、預(yù)防心腦血管疾病、護(hù)肝、明目等功效[12-13]。試驗(yàn)開發(fā)一種黑果枸杞中原花青素的高速剪切提取工藝及其咀嚼片的配方制備工藝，以黑果枸杞提取物作為功能性成分，選擇適當(dāng)?shù)妮o料，研制出口感風(fēng)味自然、營養(yǎng)豐富、易消化吸收、方便攜帶與食用，適宜快節(jié)奏生活的功能性食品黑果枸杞咀嚼片，并對其品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，該制備工藝穩(wěn)定可靠，制備方法簡單易行，具有良好的市場開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞（內(nèi)蒙古東匯生物科技有限公司），產(chǎn)地為阿拉善盟，經(jīng)鑒定為茄科（Solanaceae）、枸杞屬（Lycium）黑果枸杞的成熟果實(shí)。

原花青素（UV＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨等均為分析純；糊精、木糖醇、乳糖、麥牙糖、微晶纖維素、蘋果酸、無水乙醇均為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

Fluko FA 25高速剪切分散乳化機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；LNGNF-101實(shí)驗(yàn)室膜分離設(shè)備（上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司）；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI公司）；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；THP花籃式壓片機(jī)（上海天祥·健臺(tái)制藥機(jī)械有限公司）；YD-1硬度測定儀（精科物光有限公司）；CJY-300 C脆碎度測定儀（精科物光有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ZFD-9050真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BSA 2245-CW分析天平（Sartorius公司）；HWS 26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率測定

稱取30 g黑果枸杞，加入一定量55%乙醇，用高速剪切機(jī)處理后，離心，上清液利用160 Da膜濃縮，用相應(yīng)濃度的乙醇定容至100 mL，待測。精密量取20 mL溶液置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿，水浴蒸至近干，于真空干燥箱中以45 ℃干燥12 h，置干燥器中冷卻1 h，迅速稱質(zhì)量。按式（1）計(jì)算浸膏得率[14]。

式中：W為浸膏質(zhì)量，g；M為黑果枸杞樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 原花青素含量測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg定容于10 mL甲醇中，配制成1 mg/mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取原花青素標(biāo)準(zhǔn)液0，0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。將正丁醇與鹽酸按體積比95∶5混合后，取出6 mL置于具塞錐形瓶中，加入0.2 mL硫酸鐵銨溶液和1 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻，置于沸水浴回流，精確加熱40 min后，立即置于冰水中冷卻，在加熱完畢15 min后，于546 nm波長處測定吸光度[15-16]。

1.3.2.2 樣品測定

精密稱取適量樣品固體，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，得樣品溶液。將正丁醇與鹽酸按體積比95∶5混合后，取出6 mL置于具塞錐形瓶中，加入0.2 mL硫酸鐵銨溶液和1 mL樣品溶液，混勻，置于沸水浴回流，加熱40 min后，立即置于冰水中冷卻，在加熱完畢15 min后，于546 nm波長處測定吸光度。

1.3.3 提取方法的優(yōu)選

1.3.3.1 超聲提取法

稱取黑果枸杞5 g，加55%乙醇50 mL，超聲提取5 min（175 W），過濾，濾液定容至100 mL，待測。

1.3.3.2 冷浸提取法

稱取黑果枸杞5 g，加55%乙醇50 mL，冷浸5 min，過濾，濾液定容至100 mL，待測。

1.3.3.3 高速剪切法

稱取黑果枸杞5 g，加55%乙醇50 mL，用高速剪切機(jī)處理5 min（10 000 r/min，50 ℃），離心，上清液定容至100 mL，待測。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

稱取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），高速剪切機(jī)轉(zhuǎn)速16 000 r/min條件下，以55%乙醇為溶劑，每次提取15 min，考察提取次數(shù)對原花青素提取率的影響。

稱取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），高速剪切機(jī)轉(zhuǎn)速16 000 r/min條件下，分別以45%，55%，65%，75%和85%乙醇為溶劑提取15 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響。

稱取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），高速剪切機(jī)轉(zhuǎn)速16 000 r/min條件下，以55%乙醇為溶劑，考察時(shí)間對原花青素提取率的影響。

稱取30 g黑果枸杞，在高速剪切機(jī)轉(zhuǎn)速16 000 r/min條件下，以55%乙醇為溶劑提取15 min，考察料液比對原花青素提取率的影響。

稱取30 g黑果枸杞，在料液比1∶10（g/mL），以55%乙醇為溶劑在不同轉(zhuǎn)速條件下分別提取15 min，考察高速剪切機(jī)轉(zhuǎn)速對原花青素提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合實(shí)際使用情況考量，選擇剪切速率、料液比、剪切時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以浸膏得率、原花青素含量為評價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝。

1.3.6 咀嚼片的制備工藝流程

黑果枸杞→高速剪切提取→膜濃縮→真空濃縮→提取物→原料、輔料混合→制軟材→制粒→干燥→整粒→壓片→包裝

1.3.7 黑果枸杞原花青素咀嚼片的感官評分

由10名營養(yǎng)與食品專業(yè)人員組成評定小組，分別對黑果枸杞原花青素咀嚼片進(jìn)行評分，并計(jì)算總分。咀嚼片感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)見表1[17]。咀嚼片應(yīng)為色澤均勻一致，表面光滑有彈性，片劑成形性較好，酸甜可口，無苦澀味，入口柔順，硬度和脆度適中。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以原花青素質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=4.461 4x-0.004 5，R2=0.998 7。原花青素濃度在0～0.200 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取方法的優(yōu)選

分別考察超聲法、冷浸法、高速剪切法提取黑果枸杞中原花青素，如圖2所示，結(jié)果分別為1.285%，0.467%和2.039%。表明在相同時(shí)間內(nèi)高速剪切法明顯優(yōu)于其他2種提取方法。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 提取次數(shù)對黑果枸杞原花青素得率的影響

提取1次，2次，3次和4次后，原花青素得率分別為2.567%，2.692%，2.787%和2.833%，結(jié)果見圖3。從節(jié)約成本考慮，提取次數(shù)定為1次。

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黑果枸杞原花青素得率的影響

如圖4所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，黑果枸杞提取物中原花青素得率先逐漸增大，后逐漸減少，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到55%時(shí)，得率達(dá)到最大值，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于55%時(shí)，得率逐漸下降。可能是由于相似相溶原理，原花青素類化合物是大極性化合物，易溶于極性溶劑。乙醇體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，溶劑的極性逐漸變小，從而導(dǎo)致原花青素的溶解度降低，因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇55%。該結(jié)果與許丹丹等[18]優(yōu)化黑果枸杞中原花青素提取工藝的結(jié)果一致。

圖2 提取方法對黑果枸杞原花青素得率的影響

圖3 提取次數(shù)對黑果枸杞原花青素得率的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黑果枸杞原花青素得率的影響

2.3.3 提取時(shí)間對黑果枸杞原花青素得率的影響

由圖5所示，隨時(shí)間延長提取率上升，在15 min時(shí)達(dá)到一個(gè)較高值，而后原花青素含量隨時(shí)間延長而有所下降。推測原因有二：一是時(shí)間延長增加色素、脂類和糖類等雜質(zhì)的溶出，干擾測定結(jié)果；二是長時(shí)間的作用可能會(huì)破壞一些原花青素成分。故提取時(shí)間選擇15 min為宜。

2.3.4 料液比對黑果枸杞原花青素得率的影響

由圖6可知，料液比1∶10（g/mL）時(shí)，原花青素得率最高。可能隨著料液比增大，單位體積內(nèi)黑果枸杞顆粒濃度降低，相同時(shí)間內(nèi)對單位質(zhì)量黑果枸杞的處理次數(shù)減少，影響原花青素的溶出，且黏度也下降，減小液層摩擦力對植物細(xì)胞的破壁作用，使原花青素得率下降。

圖5 提取時(shí)間對黑果枸杞原花青素得率的影響

圖6 料液比對對黑果枸杞原花青素得率的影響

2.3.5 高速剪切機(jī)轉(zhuǎn)速對黑果枸杞原花青素得率的影響

如圖7所示，原花青素得率隨轉(zhuǎn)速增大而增加，19 000 r/min時(shí)達(dá)到最大值，而后隨轉(zhuǎn)速增加原花青素得率反而下降。可能是高速剪切引起的強(qiáng)勁的機(jī)械效應(yīng)和氣蝕作用，對原花青素聚合體有破壞作用，也增加了雜質(zhì)溶出，使其得率下降。

圖7 高速剪切機(jī)轉(zhuǎn)速對黑果枸杞原花青素得率的影響

2.4 正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

稱取30 g黑果枸杞，按表2所列因素水平正交試驗(yàn)，將試樣離心過濾，利用160 Da膜濃縮，定容，并按1.3.1和1.3.2的測定浸膏得率和原花青素得率。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

根據(jù)表3極差分析可知，以原花青素得率為評價(jià)指標(biāo)，各因素的影響依次為：剪切時(shí)間（C）＞剪切速率（A）＞料液比（B）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）。由方差分析表4可知，提取剪切時(shí)間（C）、剪切速率（A）對原花青素得率具有顯著性影響，而提取料液比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）未產(chǎn)生顯著性影響。通過對正交試驗(yàn)的結(jié)果分析，同時(shí)考慮到工業(yè)生產(chǎn)的成本、效率和剪切設(shè)備的損耗，得出黑果枸杞原花青素最佳提取條件為A2B1C3D1，即剪切速率19 000 r/min，料液比1∶8（g/mL）、剪切時(shí)間15 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%。

表2 正交設(shè)計(jì)各因素水平表

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果（n=3）

表4 方差分析

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)果見表5，表明正交優(yōu)化的提取方案可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.6 黑果枸杞原花青素咀嚼片的制備

2.6.1 黑果枸杞原花青素提取物量的確定

黑果枸杞原花青素提取物在配方中所占比例越大，營養(yǎng)價(jià)值越高，但還需同時(shí)考慮咀嚼片的口味及成型效果，對20%～50%范圍內(nèi)調(diào)整其添加量進(jìn)行壓片試驗(yàn)，結(jié)果如表6所示。

結(jié)果表明，黑果枸杞原花青素提取物添加量40%時(shí)，制出的咀嚼片品質(zhì)最好，入口順滑，無苦澀味，軟材易制粒，咀嚼片表面光滑，無黑色斑點(diǎn)。提取物添加量增加，由于黑果枸杞原花青素提取物的吸濕性較強(qiáng)，軟材黏度較大，咀嚼片表面容易出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，而且會(huì)增加咀嚼片的苦澀味。

表6 黑果枸杞原花青素提取物添加量對咀嚼片的影響

2.6.2 填充劑的選擇

咀嚼片中最常用的填充劑為淀粉、微晶纖維素和糊精，考察填充劑對咀嚼片的影響，結(jié)果見表7。

結(jié)果表明，僅使用微晶纖維素或淀粉時(shí)，制得的軟材黏度較差，制出的咀嚼片硬度差。單獨(dú)使用淀粉具有糊口感。單獨(dú)使用糊精時(shí)，咀嚼片硬度太大。將微晶纖維素和糊精混合使用時(shí)，制得的軟材黏度適中，無黏沖現(xiàn)象，咀嚼片硬度適中，無糊口感。

表7 填充劑的選擇對咀嚼片的影響

2.6.3 填充劑比例的確定

考察微晶纖維素和糊精比例對咀嚼片品質(zhì)的影響，結(jié)果見表8。

結(jié)果表明，微晶纖維素和糊精質(zhì)量比1.5∶2時(shí)，制得的軟材黏度適中，咀嚼片硬度適宜。

表8 微晶纖維素和糊精的比例對咀嚼片品質(zhì)的影響

2.6.4 甜味劑比例的確定

考察木糖醇與甘露醇的比例對咀嚼片口感的影響，結(jié)果見表9。

結(jié)果表明，木糖醇與甘露醇質(zhì)量比1∶2時(shí)口感稍有澀味，質(zhì)量比3∶1和2∶1時(shí)口感較甜，1∶1時(shí)口感較好，無明顯澀味，咀嚼時(shí)有涼爽感，適合黑果枸杞原花青素咀嚼片的制備。

表9 木糖醇與甘露醇的比例對咀嚼片口感的影響

2.6.5 蘋果酸添加量的確定

蘋果酸可以調(diào)節(jié)咀嚼片的口味，掩蓋黑果枸杞原花青素提取物的苦澀味。考察蘋果酸添加量對咀嚼片口感的影響，結(jié)果見表10。

結(jié)果表明，蘋果酸添加量5%時(shí)，咀嚼片酸甜較協(xié)調(diào)，符合消費(fèi)者的口味。

表10 蘋果酸添加量對咀嚼片口感的影響

2.6.6 咀嚼片配方的優(yōu)化

對咀嚼片的工藝配方，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化，因素水平表見表11，正交試驗(yàn)結(jié)果見表12，方差分析結(jié)果見表13。

由表12可知，咀嚼片配方影響因素大小依次為：黑果枸杞原花青提取物量（A）＞木糖醇量（C）＞蘋果酸量（D）＞微晶纖維素量（B）。由表13方差分析表可知，黑果枸杞原花青提取物量（A）、木糖醇量（C）對咀嚼片配方工藝具有顯著性影響，而蘋果酸量（D）、微晶纖維素量（B）未產(chǎn)生顯著性影響。通過對正交試驗(yàn)的結(jié)果分析，同時(shí)考慮到黑果枸杞原花青素咀嚼片的功能，得出黑果枸杞原花青素咀嚼片最佳工藝配方為A2B1C3D1，即黑果枸杞原花青提取物40%、微晶纖維素15%、木糖醇10%、蘋果酸2.5%。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，選取最佳工藝條件開展黑果枸杞原花青咀嚼片的制備，3次平行試驗(yàn)得到實(shí)際平均感官評分為47分，最佳工藝條件下制成的咀嚼片呈紫褐色，表面光滑，色澤均勻一致，入口柔順，酸甜協(xié)調(diào)，質(zhì)量差異限度、硬度等均符合中國藥典規(guī)定。

表11 正交設(shè)計(jì)各因素水平表 %

表12 黑果枸杞原花青素咀嚼片配方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表13 方差分析

3 品質(zhì)評價(jià)

3.1 感官指標(biāo)

表面光滑，形狀完整，色澤均勻一致，酸甜可口，入口柔順，硬度和脆度適中。

3.2 理化指標(biāo)

原花青含量1.34%、黑果枸杞提取物40%、微晶纖維素15%、糊精20%、木糖醇10%、甘露醇10%、蘋果酸2.5%。

3.3 微生物指標(biāo)

成品中細(xì)菌總數(shù)≤200 CFU/g，大腸桿菌未檢出，致病菌未檢出。

4 結(jié)論

經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出利用高速剪切法提取黑果枸杞中的原花青素最佳工藝為：剪切速率19 000 r/min，料液比1∶8（g/mL）、剪切時(shí)間15 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%。黑果枸杞原花青素咀嚼片最佳配方為：黑果枸杞原花青提取物40%、微晶纖維素15%、糊精20%、木糖醇10%、甘露醇10%、蘋果酸2.5%。產(chǎn)品口感細(xì)膩，酸甜可口，風(fēng)味宜人，具有廣闊開發(fā)價(jià)值和市場應(yīng)用前景。