黑加侖酵素發酵工藝優化及其體外抗氧化性能

樊秋元，朱丹，牛廣財*，魏文毅，朱立斌，張琪

1. 黑龍江八一農墾大學食品學院（大慶 163319）；2. 黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院（大慶 163319）

黑加侖學名黑穗醋栗（Ribes nigrum L.），又稱紫梅或黑豆果，為虎耳草科茶藨子屬多年生小灌木[1]。常見于我國黑龍江、吉林、新疆等地區，其果實為紫黑色小漿果，外形與藍莓較為相似。黑加侖果實中含有豐富的花色苷、多酚類物質、維生素C等營養成分，具有保護視力、抗氧化、預防心腦血管疾病和癌癥等保健功能[2]。

酵素是指使用水果、蔬菜、菌類以及食用性藥材為原料，經過酵母菌等多種有益菌發酵后而得到的，含有豐富的酶類、維生素、礦物質及次生代謝產物等的功能性微生物發酵保健性食品[3-4]。酵素具有抗疲勞、抗衰老、清除自由基等功能[5]。通過有益微生物發酵產生的酵素中，超氧化物歧化酶含量增多，具有較好的抗氧化能力。超氧化物歧化酶（SOD）能夠清除羥基自由基（OH·）、超氧陰離子自由基（O2-·）和過氧化氫等活性氧（ROS），是細胞防御系統中的主要抗氧化酶[6]。

目前，國內主要對葡萄、藍莓、蘋果、樹莓、火龍果、桂圓等酵素發酵工藝進行了較深入研究[7-12]，但關于黑加侖酵素制備工藝的研究仍鮮見報道。以新鮮黑加侖果為原料，以高效活性酵母為發酵菌種，制備黑加侖酵素。以總抗氧化能力和SOD酶活力為評價指標，通過單因素及正交試驗對其發酵工藝參數進行優化，并研究其最優發酵工藝條件下酵素產品的自由基清除能力，以期為黑加侖酵素的制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖，購于黑龍江省尚志市亞布力北方小漿果種植專業合作社；安琪牌葡萄酒專用高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，市售；福林酚，國藥集團；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津大茂化學試劑廠；SOD酶活力檢測試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。Pectinex XXL果膠酶（酶活10 000 U/mL），諾維信（中國）生物技術有限公司；有機酸標準品，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

WS 108手持式折光儀，河北潤聯科技開發有限公司；HR 7633打漿機，飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；EX 324電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡離心機，金壇市城西春蘭實驗儀器廠；UV-1100紫外可見分光光度計，上海凌析達儀器；DRP-9082電熱恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；Angilent 1200高效液相色譜，美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑加侖酵素制備工藝流程

黑加侖果→清洗、破碎→酶解→過濾→調糖→殺菌→冷卻→接種→發酵→黑加侖酵素

1.3.2 部分操作要點

1) 酶解：黑加侖清洗破碎之后，經Pectinex XXL果膠酶在50 ℃下酶解2 h，果膠酶添加量按照2.0 mL/kg添加。

2) 調糖：在室溫條件下，將白砂糖加入到黑加侖果汁中，混勻后通過手持糖度儀對其糖度進行測定，將其初始糖度調整至設定值。

3) 殺菌：采用超聲波處理15 min對黑加侖果汁進行殺菌。

4) 菌種的活化：安琪葡萄酒專用高活性干酵母按與蒸餾水1∶10倍（g/mL）溶解，在30～32 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，備用。

5) 接種：在無菌室中，按試驗設計要求的比例，對處理后的黑加侖果汁接入活化后的酵母菌。

6) 發酵：在試驗設計的溫度和時間等條件下，接種后的黑加侖果汁進行靜置發酵，在發酵過程中和結束后分別測定產品的總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.3 發酵時間的確定

調整黑加侖果汁發酵初始糖度為18%，酵母菌接種量為0.03%，發酵溫度28 ℃，發酵時間設定為24，48，72，96和120 h，測定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.4 接種量的確定

調整黑加侖果汁發酵初始糖度為18%，分別向黑加侖果汁中接入0.01%，0.03%，0.05%，0.07%和0.09%的酵母菌液，于28 ℃條件下發酵72 h，測定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.5 初始糖度的確定

調整黑加侖果汁發酵初始糖度分別為14%，16%，18%，20%和22%，酵母菌接種量為0.03%，于28 ℃條件下發酵72 h，測定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.6 發酵溫度的確定

調整黑加侖果汁發酵初始糖度為18%，酵母菌接種量為0.03%，分別在26，28，30，32和34 ℃條件下發酵72 h，測定總抗氧化能力和SOD酶活力的變化。

1.3.7 正交試驗

依據單因素試驗結果，以發酵時間、接種量、發酵液初始糖度和發酵溫度4個因素進行L9(43)正交優化試驗（表1），以總抗氧化能力和SOD酶活力為指標，確定黑加侖酵素的最佳發酵工藝條件。

表1 發酵條件優化正交試驗因素水平

1.4 檢測方法

1.4.1 黑加侖酵素總抗氧化能力的測定

將黑加侖酵素液以3 500 r/min離心10 min后，取上清液，根據總抗氧化能力試劑盒說明書進行總抗氧化能力的測定。

1.4.2 黑加侖酵素SOD酶活力的測定

將黑加侖酵素液以3 800 r/min離心10 min后，取上清液，根據SOD酶試劑盒說明書進行SOD酶活力的測定。

1.4.3 有機酸含量測定

Angilent 1200高效液相色譜檢測的條件[10]：色譜柱，Supersil AQ-C185 μ m ID 4.6 mm×250 mm；流動相，0.02 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸調pH 2.80）。液相條件：等梯度洗脫10 min；流速，1 mL/min；柱溫，30 ℃；進樣量，10 μL；檢測波長，210 nm。樣品用超純水稀釋10倍，用0.22 μm濾膜過濾后直接進樣，每個樣品重復3次。

1.4.4 黑加侖酵素超氧陰離子自由基清除能力的測定

取0.1 mL發酵液，加入4.5 mL的Tris-HCl溶液（pH 8.2），與0.4 mL的25 mmol/L的鄰苯三酚溶液混勻，在25 ℃下水浴5 min，然后加入1 mL的8 mol/L的鹽酸溶液，在325 nm波長下測定吸光度A1。空白對照以蒸餾水代替樣液，測定吸光度A0。以同體積的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，測定發酵液在體系中的吸光度A2。以4 mg/mL的VC為對照，按式（1）計算清除率：

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣液的吸光度；A2為樣液在體系中的吸光度。

1.4.5 DPPH自由基清除能力的測定

取發酵液2 mL，離心取上清液并用蒸餾水稀釋10倍得待測液。取2 mL待測液加入2 mL的0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻避光放置30 min，在波長為517 nm處測吸光度為A1，用等體積的無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測吸光度為A2，將樣品用等體積的無水乙醇代替，吸光度記A0。以4 mg/mL的VC為對照，按式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.4.6 羥自由基清除能力的測定

取10 μ L發酵液，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、FeSO4溶液，搖勻靜置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，37 ℃恒溫水浴1 h，在510 nm下測定吸光度A1，以去離子水為參比溶液，測定吸光度A0，以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測定吸光度A2。以4 mg/mL的VC為對照，按式（3）計算羥自由基清除能力：

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣液的吸光度；A2為樣液在體系中的吸光度。

1.4.7 其他指標測定

可滴定酸測定：GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》方法。菌落總數測定：參照GB 4789.2—2016《菌落總數測定》方法。大腸菌群數測定：參照GB 4789.3—2016《大腸菌群計數》方法。金黃色葡萄球菌檢驗：參照GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢驗》方法。

2 結果與分析

2.1 發酵時間對黑加侖酵素的影響

發酵時間對黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖1。由圖1可知，發酵96 h時總抗氧化能力達到最大值844.83 U/mL，之后下降；SOD酶活力在發酵第72 h達到4 869.80 U/mL，隨后趨于穩定狀態。因此，選擇酵母菌發酵黑加侖酵素的較適合發酵時間為72～120 h。

圖1 發酵時間對黑加侖酵素總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

2.2 酵母菌接種量對黑加侖酵素的影響

酵母菌接種量對黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖2。由圖2可知，接種量為0.07%時，總抗氧化能力最高，達到878.13 U/mL，SOD酶活力隨著接種量的增加而緩慢增長，在接種量為0.07%時達到最大值4 245.26 U/mL，隨后稍有下降。因此，確定酵母菌發酵黑加侖酵素的較適合接種量為0.05%～0.09%。

2.3 初始糖度對黑加侖酵素的影響

初始糖度對黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖3。由圖3可知，初始糖度在16%～20%時總抗氧化能力較高，在18%時為最大值846.07 U/mL。SOD酶活力在初始糖度為16%～20%時也較高。因此，確定酵母菌發酵黑加侖酵素的較適合初始糖度為16%～20%。

圖2 接種量對總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

圖3 初始糖度對總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

2.4 發酵溫度對黑加侖酵素的影響

發酵溫度對黑加侖酵素總抗氧化能力和SOD酶活力的影響見圖4。由圖4可知，最適發酵溫度范圍為26～30 ℃，發酵溫度在26 ℃時總抗氧化能力較高，為778.23 U/mL；SOD酶活力在發酵溫度為28 ℃時較高，為3 979.80 U/mL。因此，選擇黑加侖酵素的較適合發酵溫度范圍為26～30 ℃。

圖4 發酵溫度對總抗氧化能力與SOD酶活力的影響

2.5 黑加侖酵素發酵條件的正交試驗結果

由表2的試驗結果可知，4個因素對總抗氧化能力影響的主次順序為A＞B＞D＞C，即發酵時間＞酵母菌接種量＞發酵溫度＞初始糖度，試驗最優組合為A2B3C3D1，即最佳發酵時間為96 h、酵母菌接種量為0.09%、初始糖度為20%、發酵溫度為26 ℃；從對SOD酶活力影響情況看，其主次順序為C＞D＞A＞B，即初始糖度＞發酵溫度＞發酵時間＞接種量，試驗最優組合為A2B2C3D2，即最佳發酵時間為96 h、酵母菌接種量為0.07%、初始糖度為20%、發酵溫度為28 ℃。

表2 發酵條件的正交試驗結果及分析

2.6 驗證試驗

由表3驗證試驗可知，正交最優組合A2B3C3D1總抗氧化能力為最高為887.25 U/mL，正交最優組合A2B2C3D2為880.60 U/mL，兩種發酵條件下總抗氧化能力差異不大。但是，正交最優組合A2B2C3D2的發酵條件中SOD酶活力明顯高于A2B3C3D1的4 778.54 U/mL。因此，黑加侖酵素酵素最佳的發酵工藝條件為：最佳發酵時間為96 h、酵母菌接種量為0.07%、初始糖度為20%、發酵溫度為28 ℃。在此最佳工藝條件下進行驗證試驗，總抗氧化能力為880.60 U/mL，SOD酶活力為4 873.13 U/mL。

表3 最佳工藝條件驗證試驗

2.7 黑加侖酵素的品質指標

2.7.1 感官指標

色澤，深紫玫紅色，均一有光澤；口味，細膩，微酸；香氣，有黑加侖獨特的香氣；組織狀態，液態均勻，有微量沉淀；雜質，無外來雜質。

2.7.2 理化指標

可溶性固性物含量，7.2%；總酸（以乳酸計），4.7%；總抗氧化能力值，880.60 U/mL，SOD酶活力，4 873.13 U/mL。

2.7.3 微生物指標

菌落總數為≤100 CFU/mL，大腸菌群數≤10 CFU/mL，致病菌未檢出。

2.8 黑加侖酵素有機酸

黑加侖酵素有機酸HPLC結果如圖5。由圖5可知，8中標準有機酸分離效果很好，以各標準有機酸質量濃度對峰面積進行線性回歸，采用外標法測定黑加侖酵素有機酸種類和含量。經測定得到黑加侖酵素有機酸種類主要為：檸檬酸（2 745.27 mg/L）、蘋果酸（448.65 mg/L）、奎寧酸（188.89 mg/L）、莽草酸（23.48 mg/L）、抗壞血酸（19.59 mg/L）和草酸（19.59 mg/L）。有機酸是酵素發酵過程中改變其風味的重要因素，研究表明，有機酸種類會隨著發酵的進行而改變，果蔬發酵代謝中積累了少量丙酮酸、富馬酸和莽草酸，其中，莽草酸是多種有機酸代謝過程的重要產物[13]。

2.9 黑加侖酵素的超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是活性氧自由基的一種，可以誘導脂類、蛋白質和核酸的氧化損傷[14]。由圖6可知，黑加侖酵素發酵過程中超氧陰離子自由基清除能力在24 h內先呈急速上升的趨勢，隨著發酵時間的增加，超氧陰離子自由基清除能力呈緩慢下降趨勢。雖然發酵后的黑加侖酵素清除能力要低于4 mg/mL的VC對超氧陰離子自由基清除率（87.78%），但是，發酵后產品對超氧陰離子自由基的清除能力均高于未發酵樣品的清除率，這與發酵后酵素中的SOD酶活力增加有關，說明酵母菌發酵有利于黑加侖酵素的超氧陰離子自由基清除能力提高。

圖6 黑加侖酵素發酵過程中超氧陰離子自由基清除能力的變化

2.10 黑加侖酵素的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一個較穩定的自由基，與其他測定方法相比較，DPPH可以短時間內評價抗氧化活性[15]，因此，被廣泛應用于的抗氧化能力評價中。由圖7可知，隨著發酵時間的增加，黑加侖酵素DPPH自由基清除率呈上升趨勢。在48 h時DPPH自由基清除能力達到了96.37%，要略高于4 mg/mL的VC對DPPH自由基清除率（95.80%）。

圖7 黑加侖酵素發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

2.11 黑加侖酵素的羥自由基清除能力

羥自由基具有很強的氧化能力，羥自由基清除率是評估酵素抗氧化能力的另一個重要指標。由圖8可知，黑加侖酵素發酵至72 h時，羥自由基清除率達到了最大值（70.54%），但要低于4 mg/mL的VC對羥自由基的清除率（73.21%）。

圖8 黑加侖酵素發酵過程中羥自由基清除能力的變化

3 結論

試驗采用單因素和正交試驗對制備黑加侖黑加侖酵素工藝進行優化。結果表明，酵母菌發酵黑加侖酵素最佳發酵時間為96 h、酵母菌接種量為0.07%、初始糖度為20%、發酵溫度為28 ℃。在此最佳工藝條件下，制備的黑加侖酵素總抗氧化能力為880.60 U/mL，SOD酶活力為4 873.13 U/mL，其有機酸主要種類為：檸檬酸（2 745.27 mg/L）、蘋果酸（448.65 mg/L）、奎寧酸（188.89 mg/L）、莽草酸（23.48 mg/L）、抗壞血酸（19.59 mg/L）和草酸（19.59 mg/L）。該酵素產品對超氧陰離子自由基、DPPH自由基和羥自由基具有較好的清除能力，具有較好的抗氧化性能。