酶解海帶蛋白制備抗菌肽的工藝優(yōu)化

吳承燕，蘇羽航，王艷君，劉冬梅，王靖

福建師范大學(xué)福清分校，食品軟塑包裝技術(shù)福建省高校工程研究中心，近海流域環(huán)境測(cè)控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福清 350300）

抗菌肽（Antibacterial peptide）又稱(chēng)抗微生物肽（Antimicrobial peptide），是一類(lèi)具有抗菌活性的多肽，已在細(xì)菌、真菌、兩棲類(lèi)、昆蟲(chóng)、高等植物、哺乳動(dòng)物甚至人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)并分離，對(duì)細(xì)菌具有廣譜高效的殺菌活性[1]。抗菌肽分子量小，不易產(chǎn)生耐藥性，可用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)[2]。

海帶屬于褐子綱海帶目海帶科海帶屬，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。近年來(lái)，對(duì)海帶活性物質(zhì)的酶解提取多集中在海帶多糖、甘露醇、膳食纖維以及碘等方面[3-7]，而對(duì)海帶蛋白以及活性肽的報(bào)道較少。李偉等[8]發(fā)現(xiàn)海帶蛋白對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用，并對(duì)高血壓模型大鼠有一定的降壓作用。蔡瑾[9]發(fā)現(xiàn)海帶提取物對(duì)密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種有抑菌作用。孟然[10]發(fā)現(xiàn)海帶酶解物具有輔助降血糖、抗氧化和降血脂效果。溫志鵬等[3]利用復(fù)合蛋白酶水解海帶蛋白提取鮮味成分。

試驗(yàn)以pH、酶底比、酶解時(shí)間及酶解溫度為影響因子，以大腸桿菌為指示菌，探究海帶抗菌肽的抑菌效果，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化海帶抗菌肽的制備工藝，為海帶的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器與設(shè)備

海帶蛋白、大腸桿菌（福建師范大學(xué)福清分校實(shí)驗(yàn)室保存）；堿性蛋白酶（南京奧多福尼生物科技有限公司）；牛肉膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；瓊脂；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

YP 402 N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DK-S 24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；H-1850 R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SPX-150 B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博業(yè)有限公司）；FD-IE臺(tái)式冷凍干燥機(jī)（福州伍聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；SW-C 5-1 FD雙人垂直超凈工作臺(tái)（福州伍聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；T 22 SP紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海棱光）。

1.2 堿性蛋白酶酶解海帶蛋白

海帶蛋白的制備參考吳鳳娜等[11]的方法，并加以改進(jìn)，凍干保存。取一定量的海帶蛋白凍干粉溶于一定pH的磷酸鈉緩沖液中，置于相應(yīng)溫度的恒溫水浴鍋中預(yù)熱，加入堿性蛋白酶。酶解一定時(shí)間后95 ℃滅酶15 min，冷卻至室溫，于4 ℃、以12 000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后得到抗菌肽溶液，真空冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抑菌率的測(cè)定

凍干粉溶于超純水中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的抗菌肽溶液，抑菌率測(cè)定的方法參考姜太玲等[12]的方面，并進(jìn)行一定的修改。

大腸桿菌活化后，挑取單菌落接種于5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)10 h后，按1∶20擴(kuò)大培養(yǎng)，4 h后菌懸液濃度約為107CFU/mL。取4支滅菌試管，編號(hào)為a、b、c和d，4支試管分別加入200 μL菌懸液，a管和b管各加入1 mL超純水，c管和d管各加入1 mL抗菌肽溶液。其中a管和c管置于4 ℃作空白對(duì)照，b管和d管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，24 h后測(cè)定600 nm下吸光度A。每組試驗(yàn)各進(jìn)行3次，取平均值。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 酶解pH對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在酶底比為5%、酶解時(shí)間為4 h、酶解溫度為45 ℃的條件下，pH分別為7，8，9，10，11和12時(shí)測(cè)定對(duì)大腸桿菌的抑菌效果，考察酶解pH對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.4.2 酶底比對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在酶解時(shí)間為4 h、酶解溫度為45 ℃、pH為11的條件下，酶底比分別為2.5%，5%，7.5%，10%和12.5%時(shí)測(cè)定對(duì)大腸桿菌的抑菌效果，考察酶底比對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.4.3 酶解時(shí)間對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在酶底比為5%、酶解溫度為45 ℃、pH為11的條件下，酶解時(shí)間分別為2，3，4，5和6 h，考察酶解時(shí)間對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.4.4 酶解溫度對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

底物質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在酶底比為5%、酶解時(shí)間為4 h、pH為11的條件下，酶解溫度分別為35，40，45，50和55 ℃，考察酶解溫度對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的結(jié)果上，在pH 11的條件下，選取酶解時(shí)間、酶解溫度、酶底比三個(gè)因素為自變量，以對(duì)大腸桿菌抑菌率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，并根據(jù)最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。選取的因素水平及編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin軟件和Design Expert軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解pH對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同pH對(duì)抑菌率的影響如圖1所示。隨著pH的升高，抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，這與堿性蛋白酶的最適pH范圍相符。pH過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)影響堿性蛋白酶活性中心的構(gòu)象，從而影響其與底物的結(jié)合，使酶與底物易于解離。在pH 11時(shí)抑菌效果最佳，抑菌率達(dá)到最大值，因此后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)選擇pH 11進(jìn)行。

圖1 pH對(duì)抑菌率的影響

2.1.2 酶底比對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同酶底比對(duì)抑菌率的影響如圖2所示。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度保持1 mg/mL不變時(shí)，隨著堿性蛋白酶的增加，抑菌效果逐漸增強(qiáng)，在酶底比為10%時(shí)達(dá)到最大值，之后略有下降。酶濃度低，不足以讓海帶蛋白完全酶解，發(fā)揮其抗菌活性；加酶量過(guò)高，酶解反應(yīng)速度過(guò)快，可能將部分多肽酶解成更小的肽段，喪失其抗菌活性。因此，控制酶底比7.5%，10%和12.5%進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同酶解時(shí)間對(duì)抑菌率的影響如圖3所示。抑菌率隨時(shí)間增加而緩慢增加，在5 h時(shí)達(dá)到最大值，之后抑菌效果下降。酶解時(shí)間太短，可能某些具有抑菌活性的氨基酸殘基尚未暴露出來(lái)，無(wú)法充分發(fā)揮功能。酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抗菌肽被降解，導(dǎo)致抑菌率降低。因此，選擇4，5及6 h作為優(yōu)化試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖2 酶底比對(duì)抑菌率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)抑菌率的影響

2.1.4 酶解溫度對(duì)海帶抗菌肽抑菌率的影響

不同酶解溫度對(duì)抑菌率的影響如圖4所示。曲線呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。酶解溫度較低，未達(dá)到分子活化溫度，酶與底物碰撞概率較低，底物被酶解的概率也相應(yīng)較低；溫度過(guò)高，雖然分子熱運(yùn)動(dòng)速度增快，但酶內(nèi)的一些次級(jí)鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化，影響催化效率。因此優(yōu)化試驗(yàn)的酶解溫度可選擇35，40和45 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)抑菌率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，得到抑菌率與酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）和酶底比（C）的二次回歸模型：Y=-29.29-0.76A+0.90B-2.45C+1.01AB+1.73AC+0.77BC-3.26A2-4.48B2-1.60C2。回歸分析與方差分析結(jié)果如表3所示。該模型p＜0.000 1，表明具有極顯著性，失擬項(xiàng)p=0.571 4＞0.05，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著，R2=98.25%，R2Adj=96.00%，表明模型與試驗(yàn)擬合良好，可以用此模型對(duì)抗菌肽抑菌效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。影響抑菌率的各因素主次順序?yàn)镃＞B＞A。一次項(xiàng)中A、B影響顯著，C影響極顯著，二次項(xiàng)中BC影響不顯著，AB影響顯著，AC、A2、B2、C2影響極顯著。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

各交互作用對(duì)抑菌率的影響如圖5～圖7所示。響應(yīng)面曲面坡度的陡峭或平緩程度反映出海帶抗菌肽抑菌效果響應(yīng)值的靈敏度。從曲面的坡度可知，酶解時(shí)間與酶底比、酶解時(shí)間與酶解溫度交互作用明顯，酶解溫度與酶底比交互作用不明顯，這與表3中的結(jié)果相符。

利用響應(yīng)面法優(yōu)化出海帶抗菌肽制備的最佳工藝為酶解時(shí)間4.62 h、酶解溫度39.86 ℃、酶底比7.55%，此條件下抑菌率的理論值為30.62%。鑒于試驗(yàn)操作的便利性，調(diào)整酶解時(shí)間為4.6 h、酶解溫度為39.9 ℃、酶底比為7.6%，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得抑菌率的平均值為30.14%，與預(yù)測(cè)結(jié)果相差1.6%，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化海帶抗菌肽制備的工藝條件準(zhǔn)確可靠，通過(guò)試驗(yàn)所建立的模型可用于實(shí)際應(yīng)用。

圖5 酶解時(shí)間與酶解溫度對(duì)抑菌率的影響

圖6 酶解時(shí)間與酶底比對(duì)抑菌率的影響

圖7 酶解溫度與酶底比對(duì)抑菌率的影響

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)以海帶蛋白為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)與Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化堿性蛋白酶酶解制備抗菌肽的工藝，預(yù)測(cè)得到的最佳參數(shù)為酶解時(shí)間4.6 h、酶解溫度39.9 ℃、酶底比7.6%。在pH 11、底物質(zhì)量濃度1 mg/mL的條件下，3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值為30.14%，與預(yù)測(cè)值30.62%接近，表明采用響應(yīng)面法具有一定的可行性。

試驗(yàn)僅以大腸桿菌為指示菌，后續(xù)工作會(huì)繼續(xù)評(píng)價(jià)對(duì)其他細(xì)菌、真菌的抑菌效果，并對(duì)酶解產(chǎn)生的多肽成分進(jìn)行分離純化，通過(guò)結(jié)構(gòu)測(cè)定確定其抗菌機(jī)理。在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上，可開(kāi)發(fā)海帶抗菌肽在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，并為海帶的加工利用提供新參考。