新型冠狀病毒感染的臨床表現及其實驗室檢測技術進展*

魏徵霄 綜述,李青峰 審校

(四川省成都市公共衛生臨床醫療中心,四川成都 610066)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于冠狀病毒屬，是一種陽性單鏈RNA病毒,主要通過呼吸道傳播的RNA病毒,具有極高傳染性,被世界衛生組織(WHO)列為對人類危害最嚴重的病毒之一。但鑒于目前尚無特異性的靶向殺滅SARS-CoV-2的藥物，而認識SARS-CoV-2結構、感染機制和實驗室檢查可能有助于開發有效的治療方法，故本文就SARS-CoV-2特征、感染的臨床表現及其實驗室檢測技術研究進展予以綜述，以期為更好地防控、診斷和治療COVID-19提供參考。

1 病毒學特征與流行病學特點

冠狀病毒是球形或橢圓形的,有包膜,基因組為線性單股正鏈的RNA,在自然界中廣泛存在的一類病毒。它們的宿主范圍很廣,包括鳥類、農場動物、寵物、駱駝和蝙蝠,主要引起呼吸道和胃腸道疾病。直到1975年,世界病毒命名委員會對其進行正式命名,其目、科屬的關系才真正弄清楚:它們屬于巢病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)和正冠狀病毒亞科(Orthocoronaviridae)。冠狀病毒有四個屬,分別是Alphacoronavirus、Betacoronavirus、Deltacorona和Gammacoronavirus[1-3]。SARS-CoV-2屬于Betacoronavirus。

在2019年12月之前,科學界共發現有6種致病性的冠狀病毒,它們是屬于Alphacoronavirus屬的HCoV-229E和HCoV-NL63,以及屬于Beta冠狀病毒屬的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV[1-2]。其中有4種冠狀病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)較常見,容易引起兒童和成人發生類似普通感冒的輕微呼吸道癥狀,致病性較低,醫學重視性不高。另外急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征的冠狀病毒(MERS-CoV)可以產生嚴重的下呼吸道感染,這兩種冠狀病毒都能導致人畜共患病,SARS和MERS的冠狀病毒曾大規模暴發,在感染者中造成極高病死率(分別為10%、37%),構成了重大的公共衛生威脅和重大生命財產損失[1,4]。

ZHU等[5]研究報道通過對肺炎患者樣本進行測序,發現了一種新的β冠狀病毒屬(β-coronavirus)病毒,命名為2019年新型冠狀病毒肺炎(COVID-19),該病毒與中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)和嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)不同,成為可以感染人類的冠狀病毒科的第7個成員。

中國疾控中心(CDC)團隊在患者下呼吸道取得樣本,通過測序獲得病毒的完整基因序列。將基因組序列、引物、標準操作程序與WHO共享,有助于開發靈敏的RT-PCR檢測技術,實現快速檢測。病毒株的獲取也有利于推動血清學檢測技術,以期開發更靈敏的檢測標志物。

2 SARS-CoV-2感染:COVID-19及其臨床表現

2.1 傳播方式 研究者通過測序發現SARS-CoV-2與蝙蝠冠狀病毒最密切相關,甚至在nsp7和E蛋白中與Bat-SL-CoVZC45表現出100%的氨基酸相似性,整體基因組序列一致性為96.2%,通過對蝙蝠中多種SARS樣冠狀病毒的鑒定,推斷蝙蝠可能是這些病毒的天然宿主[6-7]。但是,由于首次報告該病時市場上有多種其他動物在售,因此需要更多的調查來確定SARS-CoV-2的天然宿主和中間宿主。

SARS-CoV-2過呼吸道進入人體[8],感染導致COVID-19,其主要傳播方式以呼吸道飛沫為主,普通人群易感,平均潛伏期為5.2 d,基本繁殖數(R0)為2.2。大多數COVID-19患者為臨床輕度病例。也有研究者指出患有基礎疾病(包括高血壓、糖尿病、心臟病和/或腎病等)的老年男性死亡風險更高[7]。

有研究者從COVID-19感染者的糞便樣本中分離出SARS-CoV-2,證實了糞便中的確存在活病毒[9],但是,SARS-CoV-2的感染是否存在糞口傳播途徑還有待于科學界進一步證實。

目前也有新生兒出生30 h后發生COVID-19的病例,母嬰傳播是否真實存在,尚待進一步明確。而且有研究指出，減少人群聚集,并對潛在感染人群采取隔離等措施能有效預防或減少傳播的可能[10-11]。

2.2 感染機制 有研究表明SARS-CoV-2主要通過Spike蛋白(S蛋白)與宿主細胞血管緊張素轉化酶2(ACE2)受體結合來介導病毒的入侵,冠狀病毒S蛋白S1亞單位的N端結構域(S1-NTD)和C端結構域(S1-CTD)都能作為受體結合域(RBD)[12-13]。一般認為S1-NTD結合糖類受體,S1-CTD結合蛋白類受體。

病毒通過S蛋白中的Arg426與ACE2中的Gln325/Glu329之間的氫鍵相互作用,來感染人的呼吸道上皮細胞,進入細胞后,病毒RNA釋放出來,并整合到宿主的遺傳物質中,不斷地繁衍復制,并通過胞吐作用將病毒顆粒從被感染的細胞中釋放出來；同時SARS-CoV-2和細胞表面的ACE2一同過入胞內,導致細胞表面ACE2蛋白減少,ACE2蛋白的主要生理功能是擴展血管,調節血壓,與高血壓、糖尿病、冠心病等代謝病密切相關,這也從側面解釋了具有基礎疾病的人群COVID-19的易感性。COVID-19的感染機制還有很多未知,某些假設或推斷亟待科學界繼續深入研究以獲取更多更可靠的證據。

2.3 臨床表現 COVID-19以發熱、干咳、乏力為主要特征,伴或不伴有發熱,部分伴有鼻塞、流涕、咽痛等類似感冒癥狀。根據國家衛生健康委員會辦公廳、國家中醫藥管理局辦公室印發的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第6版)》，重癥患者可發展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒血癥休克、代謝性酸中毒、凝血功能障礙及多器官衰竭等,并出現明顯的肺部影像學變化。

在一項針對41名住院患者的研究中,大多數患者均報告有發燒、干咳、肌肉酸痛和疲勞癥狀,很少出現咳嗽、頭痛、咯血和腹瀉的癥狀[14]。根據該研究,這些患者中約有一半患有合并癥,例如潛在的糖尿病,高血壓和心血管疾病。此外,患者入院后平均約8 d出現呼吸困難并伴有異常胸廓CT和肺炎,與病毒性肺炎相似,患者的X射線或胸部CT圖像顯示單側或雙側肺部受累。臨床并發癥包括急性呼吸窘迫綜合征、急性心臟損傷、繼發感染和氣胸等,這也與CHEN等[15]關于99例病例的回顧性分析的臨床表現大致相同。

COVID-19感染者血細胞計數顯示白細胞減少和淋巴細胞減少,部分患者出現部分生化指標的異常,ICU患者的凝血酶原、D-二聚體和細胞因子處于較高水平[14]。因為COVID-19輕癥的臨床表現與流行性感冒相似缺乏特異性,所以無法僅從患者的臨床表現診斷SARS-CoV-2感染,在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第6版)》將實時熒光RT-PCR核酸檢測陽性或病毒基因測序作為金標準。

3 SARS-CoV-2感染的實驗室檢測

COVID-19的臨床診斷必須依據患者相關的流行病學史(兩周內的活動或旅行地區為武漢或14 d內有SARS-CoV-2感染者的接觸史)、臨床癥狀、實驗室檢測結果等予以綜合性判斷,目前確診以實驗室檢查為準,改變的是判讀的方式。對SARS-CoV-2感染的實驗室診斷主要有病原學和血清學等檢測技術。檢測的樣本可以是疑似患者的鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等。

3.1 病原學診斷

3.1.1 基因測序 病毒的全基因組測序是研究病毒進化、毒力因子變異的基礎。在COVID-19暴發的初期,有研究通過二代測序獲得了該病毒的整個基因組序列,并對7個保守的非結構蛋白序列比對分析,發現SARS-CoV-2與SARS-CoV同源性(79.5%)[16]。同樣的有研究者也發現了SARS-CoV-2與NC_004718、bat-SL-CoVZC45和蝙蝠中檢測到的冠狀病毒(bat/Yunnan/RaTG13/2013)具有極高的基因組序列相似度(80%、88%、96%)[17]。基于數據共享理念,國家生物信息中心(CNCB)/國家基因組科學數據中心(NGDC)建立了2019新型冠狀病毒信息庫(2019nCoVR https://bigd.big.ac.cn/ncov),為檢測試劑盒研發、抗病毒藥物靶點設計等相關研究提供了支持。

3.1.2 核酸檢測 病毒核酸可用于早期檢測。根據《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第2版)》，現已建立的SARS-CoV-2特異性核酸檢測技術其病毒目標片段是病毒ORF1ab和N基因,采用一步法、磁珠法或柱提法反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)或實時熒光RT-PCR技術[13]。

與普通PCR相比,實時熒光 RT-PCR利用信號實時監測PCR反應過程中每一個循環擴增產物量的變化,可以對初始模板量進行定量檢測分析。具有靈敏、特異、準確、快捷且重復性好等諸多優勢,深受臨床檢驗工作者青睞。CORMAN等[18]在沒有病毒基因組核酸物理來源的情況下,建立了一種基于實時熒光RT-PCR技術,基于網絡公布的2019新型冠狀病毒數據庫,設計的特異性引物檢測RdRP基因、E、N基因,以此檢測SARS-CoV-2,并進一步將SARS-CoV-2與SARS-CoV區別開來。ZHOU等[13]開發了一種基于刺突基因受體結合域的實時熒光定量PCR檢測方法,應用于當時7例病毒感染者血液、咽拭子及肛拭子樣本的檢測,能夠將SARS-CoV-2與包括人類在內的所有其他冠狀病毒分開。CHU等[19]報道了兩種用于檢測SARS-CoV-2的單步實時反轉錄聚合酶鏈反應檢測方法的開發。兩種測定法靶向病毒基因組的Orf1b和N區,發現N檢測比靶向Orf1b的檢測更為靈敏。筆者建議將前者用作篩選測定,而將后者用作診斷測定。

3.1.3 病毒的分離與培養 病毒的分離與培養是病毒感染實驗診斷的經典技術,也是病原學鑒定的“金標準”。對于SARS-CoV-2,病毒研究機構可以通過經典的科赫氏法則對該病毒進行初步鑒定,并通過電子顯微鏡觀察其形態[20]。

ZHOU等[13]以哺乳動物細胞系Vero、Vero E6和Huh7為感染材料進行了SARS-CoV-2的分離與培養,并通過RT-PCR證實了病毒的存在。但是病原體的分離與培養需要時間長、實驗室技術條件要求高,不宜于快速診斷,但分離的純培養毒株對于病原體的生物學特征、感染機制、治療藥物及疫苗的研究等都是不可或缺的。

3.2 免疫血清學檢測 由于分子診斷和病毒培養受限制條件較多,開發血清學檢測試劑引起了科學界極大的興趣。已報道對MERS-CoV檢測的血清學方法包括中和試驗(NT)、酶聯免疫吸附測定試驗(ELISA)、間接免疫熒光(IFA)、蛋白質微陣列(PM)、免疫印跡(Western-blot)等[21]。整體來說,血清學檢測相比核酸檢測,易于快速操作,但靈敏度和特異度較低[22-23]。

ELISA基于抗原與抗體特異結合特點,利用酶的催化與信號放大作用,來判斷樣本的陰陽性,是目前血清學檢測通用的方法之一[24]。在ELISA早期方法建立中,主要以滅活病毒株為抗原制備單克隆抗體[25]。大多數冠狀病毒具有相似的病毒結構,相似的感染途徑和相似的S蛋白結構[26],這表明相似的研究也可能適用于SARS-CoV-2。QIU等[27]用含有S蛋白的可溶性重組RBD免疫野生型小鼠,然后將小鼠進行人源化分離,或直接免疫轉基因小鼠以獲得人源化的抗體,用于治療MERS-CoV感染。

有研究使用編碼冠狀病毒刺突蛋白的基因,證實了假病毒中和抗體測試(ppNT),具有很高的靈敏度和特異度[28-29]。這也為將來開發鑒定SARS-CoV-2的相關抗原和單克隆抗體提供了借鑒。JIANG等[30]證明了SARS-CoV S蛋白中的RBD是SARS患者中和抗體的主要靶標,并且能夠在動物模型中誘導高效的中和抗體應答和長期保護性免疫,它包含6個不同的構象的中和表位,能產生了一系列具有不同中和活性的小鼠單克隆抗體(mAb),該小組還表明,這些SARS-CoV-RBD特異性中和單克隆抗體可以交叉中和蝙蝠SL-CoV,例如蝙蝠SL-CoV-W1V1[31],從一定程度上表明這些抗體也可以交叉中和SARS-CoV-2。

有研究者針對98例SARS患者的研究發現一般在感染7 d后可以發現IgM陽性,并在發病3周后陽性最高,15 d左右出現IgG陽性,60 d左右陽性最高,且持續時間較長[32]。ZHANG等[33]使用SARSr-CoV Rp3 NP作為抗原開發的用于檢測SARS-CoV-2的IgG和IgM ELISA試劑盒,連續監測15例COVID-19患者IgG和IgM的滴度變化,發現采樣第5天IgG的陽性率(81%～100%)和IgM的陽性率(50%～81%)都大幅增加,這與核酸相對較低的陽性檢出率(50%)相反。蛋白印跡比ELISA更加特異,但由于過程繁瑣,更適用于驗證抗體的存在,不適用于大批量樣本篩查[21]。

4 總結及展望

SARS-CoV-2與SARS-CoV和MERS-CoV同源,它們都屬于Beta冠狀病毒。由于SARS-CoV-2在全球范圍內傳播,這對臨床管理構成重大挑戰,對公共健康構成了巨大威脅。目前尚沒有疫苗或針對性藥物治療SARS-CoV-2感染,所以實驗室檢測手段的加強能夠縮短檢出時間,在一定程度上減少甚至遏制病毒的傳播。

目前雖然已經有許多實驗室檢測方法可以用于SARS-CoV-2的檢測。病毒分離培養耗時長,對樣本保存要求較高,限制了在實際工作中的應用。核酸檢測可以在P2級實驗室中將病毒滅活后進行檢測,在目前的實驗室檢測技術中應用較為廣泛,抗原抗體檢測方法由于操作簡便易行,在時間工作中更易于推廣。

在疫情暴發的當下,鑒于實驗室檢測結果在疾病診斷中的重要作用,呼吁多種檢測方法聯合使用,更快更準確地對疾病進行診斷。由于SARS-CoV-2的高度傳染性,操作簡單、設備簡單、樣本用量少、能快速現場進行檢測的試劑開發是今后SARS-CoV-2檢測的發展方向。