和胃反流康對膽汁反流性胃炎模型大鼠血清及胃黏膜組織白細胞介素6、白細胞介素8的含量及表達水平的影響※

汪 楠 李 巖

(遼寧中醫藥大學附屬醫院GCP辦公室，遼寧 沈陽 110032)

膽汁反流性胃炎(bile reflux gastritis，BRG)是多種原因引起胃黏膜組織損傷的一種疾病，由十二指腸胃反流(duodenogastric reflux，DGR)現象異常增多導致[1]，屬消化內科常見疾病之一，其發生與幽門功能下降、胃竇清除能力降低、十二指腸動力異常等因素有關[2]。這些因素的存在既可增加DGR，又可延緩胃排空，延長胃黏膜與反流液的接觸時間，從而加重胃黏膜損傷。目前，現代醫學對BRG的治療主要應用促胃動力藥、胃黏膜保護劑及抑酸劑等，增加了耐藥性及藥物副作用的可能，不宜長期服用。大量臨床實踐表明，中藥具有療效高、靶點多、副作用小等優勢，更有益于BRG的治療。和胃反流康是我院脾胃病科多年臨床觀察篩選的效方，廣泛用于治療各類消化性疾病，如慢性非萎縮性胃炎、BRG、非潰瘍性消化不良等，有疏肝利膽、益氣健脾、和胃降逆功效，可明顯緩解患者胃痛、胃脹、反酸、燒心、嘈雜等癥狀。炎癥細胞因子在BRG的發生發展中起著至關重要的作用，在眾多炎癥細胞因子中，白細胞介素6(IL-6)、IL-8的作用表現尤為突出。本實驗通過比較BRG模型大鼠血清及胃黏膜IL-6、IL-8的含量及表達水平變化，了解和胃反流康對胃黏膜炎性損害的改善，從而觀察其對胃黏膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量(200±20)g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物合格證號：SCXK(遼)2010-0001。飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物室，常規顆粒飼料飼養，室溫(20±2) ℃，相對濕度45%，12 h晝夜節律，自由食水。

1.1.2 實驗藥物及試劑 和胃反流康藥物組成：柴胡15 g，陳皮10 g，白芍10 g，枳殼10 g，香附15 g，炒白術15 g，茯苓10 g，黃連6 g，蒲公英20 g，半夏10 g，甘草10 g。以上中藥均購自遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局，水煎濃縮，分別制成含量為5.46、2.73、 1.37 g生藥/mL的高、中、低混懸液。多潘立酮片(西安楊森制藥有限公司，國藥準字H20093426)，制成含量為0.278 mg/mL的混懸液。牛磺膽酸鈉(北京博奧拓達科技有限公司)；胰酶(美國Amresco公司)；卵磷脂(美國Sigma公司)；4%多聚甲醛溶液(南京森貝伽生物科技有限公司)；10%水合氯醛溶液(上海聯碩生物科技有限公司)；IL-6、IL-8酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-6免疫組化試劑盒含試劑(武漢云克隆科技股份有限公司)；IL-8免疫組化試劑盒含試劑(美國Sigma公司)。

1.1.3 實驗儀器及設備 離心機(C4-12型，法國捷安公司)；酶標儀(Antho2010型，奧地利安圖公司)；移液器(美國熱電公司)；水浴恒溫振蕩器(SHA-B型，常州國華儀器設備廠)；全自動脫水機、包埋機、輪轉式切片機、Q550CW圖象采集和分析系統(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 反流液配制 依據相關文獻[3]，將牛磺膽酸鈉2.5 g、胰酶1.5 g、卵磷脂0.25 g溶于蒸餾水100 mL中配制成反流液。

1.2.2 動物分組 將60只Wistar大鼠按照隨機數字法分為6組，即空白組、模型組、對照組及和胃反流康高、中、低劑量組，每組10只。

1.2.3 動物造模 除空白組外，其余各組大鼠用配制好的反流液灌胃造模，給藥容積為15 mL/kg，每日1次，連續5周。

1.2.4 給藥 各給藥組自造模第2周開始至造模結束，每日造模結束6 h后灌胃給藥，每日1次[4]。和胃反流康高、中、低劑量組分別予和胃反流康54.6、27.3、13.7 g生藥/kg灌胃；對照組予多潘立酮片2.78 mg/kg灌胃；空白組、模型組予等容積蒸餾水灌胃。

1.3 取材及指標檢測 (1)血清IL-6、IL-8含量檢測。各組大鼠末次給藥前1 d，禁食不禁水24 h，末次給藥后，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，采集腹主動脈全血，常溫下靜置1 h后，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃凍存，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清IL-6、IL-8含量。(2)采集完腹主動脈全血后，免疫組化法檢測胃竇部胃黏膜組織IL-6、IL-8表達水平。每組隨機取6只大鼠，無菌操作剖腹取胃，將胃內容物用冰0.9%氯化鈉注射液漂洗干凈，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存備用。常規制備石蠟切片，將固定好的胃竇組織取出，自來水下充分沖洗，沖洗后經全自動脫水機脫水；透明、浸蠟和包埋(包埋機上進行)；輪轉式切片機切片，脫蠟、水化，微波修復，血清封閉，分別加相應的一抗孵育，4 ℃過夜，加二抗后顯色。選擇染色良好的區域，封片。每只大鼠觀察4張切片，每張切片選取5個互不重疊視野，顯微鏡下(40×10)觀察IL-6、IL-8表達水平，陽性表達為棕黃色顆粒沉著。應用Q550CW圖象采集和分析系統，測定單位面積陽性細胞表達的平均光密度值(AOD)作為其水平表達。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清IL-6、IL-8含量比較 見表1。

表1 各組大鼠血清IL-6、IL-8含量比較

由表1可見，模型組大鼠血清IL-6、IL-8水平均高于空白組(P<0.05)；和胃反流康高、中、低劑量組及對照組大鼠血清IL-6、IL-8水平均低于模型組(P<0.05)；和胃反流康高劑量組大鼠血清IL-6水平低于對照組(P<0.05)，和胃反流康低劑量組大鼠血清IL-6水平高于對照組(P<0.05)，和胃反流康中劑量組大鼠血清IL-6水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。和胃反流康低劑量組大鼠血清IL-8水平高于對照組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑量組與對照組大鼠血清IL-8水平兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD比較 見表2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD比較

由表2可見，模型組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD均高于空白組(P<0.05)；和胃反流康高、中、低劑量組及對照組大鼠胃黏膜組織IL-6 AOD均低于模型組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑量組及對照組大鼠胃黏膜組織IL-8 AOD均低于模型組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑組及對照組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD均低于和胃反流康低劑量組(P<0.05)；和胃反流康高、中劑量組及對照組大鼠胃黏膜組織IL-6、IL-8 AOD兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組大鼠胃黏膜組織IL-6表達免疫組化觀察 各組大鼠胃黏膜組織的上皮細胞和浸潤的炎癥細胞均能表達IL-6，其中空白組大鼠胃黏膜組織細胞漿內未見明顯棕黃色顆粒沉著；模型組大鼠胃黏膜組織細胞漿內可見大量棕黃色顆粒，細胞核亦可見棕黃色著色，提示IL-6表達水平較高；和胃反流康高、中、低劑量組及對照組大鼠胃黏膜組織細胞漿內雖有棕黃色顆粒沉著，但顏色淺、顆粒少，提示IL-6表達水平較低。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織IL-6表達(免疫組化染色，×400)

2.4 各組大鼠胃黏膜組織IL-8表達免疫組化觀察 各組大鼠胃黏膜組織的上皮細胞和浸潤的炎癥細胞均能表達IL-8，其中空白組大鼠胃黏膜組織細胞漿內未見明顯棕黃色顆粒沉著；模型組大鼠胃黏膜組織細胞漿內可見大量棕黃色顆粒，細胞核亦可見棕黃色著色，提示IL-8表達水平較高；和胃反流康高、中劑量組及對照組大鼠胃黏膜組織細胞漿內雖有棕黃色顆粒沉著，但顏色淺、顆粒少，提示IL-8表達水平較低；和胃反流康低劑量組在細胞膜、細胞漿及細胞外間質均可見較多棕黃色顆粒沉著，與和胃反流康高、中劑量組及對照組比較，黃棕色顆粒沉著范圍較大，顏色較深，但與模型組比較，黃棕色顆粒沉著范圍較小，顏色相對較淺，提示和胃反流康低劑量組IL-8表達水平高于和胃反流康高、中劑量組及對照組，低于模型組。見圖2。

3 討 論

BRG屬中醫學胃脘痛、膽癉、嘈雜、嘔吐等范疇，病位在胃，與肝、膽、脾功能失調密切相關，其病因主要包括外邪侵襲、飲食不節、情志失調、久病體虛等，基本病機為氣機不利，胃失和降。氣機不利日久，氣郁而化火灼津，以致胃失和降，膽汁隨胃氣上逆，灼傷胃絡，此為導致BRG發生的主要原因之一。常見臨床表現有上腹部飽脹不適，胸骨后燒灼感及疼痛感，可與腹脹、噯氣、反酸、燒心、嘈雜、惡心等癥狀同時出現，本病病程較長，癥狀緩解困難且易復發，因此給患者身心造成極大的壓力與痛苦[5]。隨著消化內鏡廣泛應用于臨床，BRG檢出率也隨之上升，約占同期胃鏡檢出率的22.6%～50.0%[6]。

在BRG形成過程中，膽汁酸是造成黏膜損傷的最主要因素，胰酶和溶血卵磷脂次之。膽汁酸是膽汁的主要成分，屬親脂性類固醇，其“皂化”特性極強，胃黏膜屏障也因此受損[7]。大量研究表明，長時間反流與胃黏膜活動性炎癥、萎縮、腸上皮化生相關，尤其與幽門螺桿菌(Hp)感染同時存在時，胃黏膜腸上皮化生的可能性會大大增加[8-10]。炎性反應的發生發展過程中，炎癥因子起著重要作用，其中IL-6、IL-8表現尤為突出。作為具有多種生物學活性的細胞因子，IL-6對于炎癥、防御、腫瘤形成等免疫反應均有較強的調節功能。同時，作為重要介質，IL-6參與機體炎性反應和一系列病理生理過程，可誘導T淋巴細胞、B淋巴細胞分化，從而增強單核細胞及自然殺傷(NK)細胞的殺傷功能。在IL-6參與下，部分腫瘤壞死因子(TNF)如TNF-ɑ可誘導凝血酶形成，使上皮細胞表面由抗凝轉為促凝，導致因微血栓形成而引起的胃黏膜血液循環障礙，從而大大削弱胃黏膜的防御修復機制[11]。目前已知，作為最強的多形核白細胞趨化和激活因子，IL-8主要生物學效應為刺激中性粒細胞向炎性組織聚集，誘導中性粒細胞的吞噬作用，使溶酶體酶的生物活性提高，并促進其釋放，導致中性粒細胞呼吸爆發，生成活性氧代謝物，從而加劇局部組織炎癥和潰瘍[12]。此外，IL-8還可趨化其他白細胞亞類，如嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞等[13]。目前研究表明，IL-8可作用于多種細胞，加速炎性反應進程，促進有絲分裂，刺激血管形成，調節宿主免疫功能，在多種炎性反應性疾病、腫瘤及免疫相關疾病的起病過程中發揮重要作用[14]。研究認為，IL-8與胃黏膜損傷的嚴重程度及炎癥分級具有一定相關性[15]。本實驗采用BRG大鼠模型，進一步研究和胃反流康對炎癥因子IL-6、IL-8含量及表達的影響，探討其對胃黏膜組織損傷的修復和改善作用機制。實驗結果表明，和胃反流康可降低大鼠胃黏膜組織中IL-6、IL-8含量(P<0.05)，抑制IL-6、IL-8表達水平(P<0.05)。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織IL-8表達(免疫組化染色，×400)

綜上所述，和胃反流康可顯著減少BRG大鼠血清IL-6、IL-8含量，抑制胃黏膜組織IL-6、IL-8表達，減輕反流液對胃黏膜的炎性損害，有助于胃黏膜組織損傷的修復和改善，從而更好地保護胃黏膜，為其在臨床上治療BRG提供了現代藥理學依據，為進一步擴大其臨床適應證、加速其臨床推廣提供了實驗依據。