無創DNA陽性結果的驗證分析及臨床意義

黎洛冰 梁西嵐 聶俊瑋

[摘要]目的 對比分析無創DNA產前檢測陽性結果與產前診斷結果，為無創DNA臨床應用提供臨床應用依據。方法 選取2016年1月～2018年3月在茂名市產前診斷中心因無創DNA產前檢測結果陽性的孕婦86例給予羊水或臍靜脈穿刺進行核型分析，并對參與無創DNA產前檢測結果陰性的孕婦5008例進行隨訪。觀察無創DNA檢測結果準確率、不同危險分析度孕婦檢測結果的準確性。結果 86無創DNA陽性結果，經染色體核型分析驗證，無創DNA檢測準確率為66.28%，其中18三體檢測準確率為100.00%，21三體檢測準確率為82.93%，13三體及性染色體異常的檢測準確率分別為66.67%、60%。高齡組、唐氏高風險組、其它高危因素組孕婦無創DNA陽性準確率分別為62.86%、72.73%、65.52%，三組準確率比較，差異無統計學意義（P>0.05），其余5008例無創DNA結果陰性者截止2018年3月經隨訪未發現有唐氏綜合征患兒出生，其他先天性畸形7例，其中先天性心臟病3例，多指/趾2例，唇腭裂2例。所有胎兒均正常出生。結論 無創DNA是產前篩查21、18、13三體綜合征的有效方法，對于其它染色體異常也具有重要提示意義。但無創DNA存在假陽性，對于無創DNA檢測結果陽性，建議進一步行介入性產前診斷確診。

[關鍵詞]無創DNA;產前診斷;出生缺陷;染色體

[中圖分類號]R714.15

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2020）01-256-05

預防胎兒出生缺陷，對嚴重智力障礙及畸形的胎兒盡早檢出并及早終止妊娠是提高出生人口質量的重要手段之一[1]。染色體非整倍體異常是導致胎兒出生缺陷的重要原因，有數據統計缺陷兒的出生率為活產兒的3%，全世界每年約有500萬嬰兒出生時伴有缺陷，平均5～6min即有一名出生，其中85%發生在發展中國家[2]。我國先天缺陷兒的總數為80～120萬，占我國出生人口總數的4%。這部分新生兒既沒有很好的生存質量，同時也為家庭和社會帶來巨大的負擔。胎兒染色體病的傳統產前診斷方式是通過獲取胎兒的絨毛、羊水、臍血等來進行診斷，但是這些侵入性操作對胎兒和孕婦均有一定風險，可能導致宮內感染的發生，甚至有可能導致流產等不良后果[3]。無創DNA產前檢測技術，是一種利用新一代DNA測序技術對母體外周血漿中的游離DNA片段進行測序并將結果進行生物信息分析的技術，該技術不需要取得胎兒的組織，僅通過孕婦的靜脈血即可進行檢驗[4]。為了驗證無創DNA陽性結果的準確性，探討其在臨床應用價值，我院進行了本次研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2016年1月～2018年3月在茂名市產前診斷中心因無創產前基因檢測結果陽性的孕婦86例和5008產前診斷中心因無創產前基因檢測結果陰性的孕婦進行臨床研究，年齡22～46歲，平均（32.1±5.8）歲，孕周12～24周，平均孕周（18.7±5.0）周，均為單胎妊娠。根據患者風險原因分為高齡組35例，唐氏高風險組22例，其他高危因素組29例，三組孕婦年齡、孕周比較，差異無統計學意義（P>0.05）。具有可比性。納入標準[5]：（1）自愿行羊膜腔穿刺或臍靜脈穿刺術的孕婦;（2）使用染色體核型分析對無創結果進行驗證，染色體微缺失或微重復還建議進行Array-CGH項目檢查;（3）孕婦病例資料完整，隨訪取得妊娠結局。排除標準[6]：不能按照要求完成介入性產前診斷的孕婦。

1.2方法

1.2.1羊水穿刺 穿刺前常規給予血常規、地貧電泳、凝血功能、乙肝、梅毒、艾滋病等檢測，在超聲下觀察胎盤位置等情況，確定進針點，無菌條件下經腹抽取羊水30mL，羊水標本置入無菌離心管中1200r/min離心10min，后去上清，留取沉淀（羊水細胞），加入羊水培養液10mL渾勻接種于培養瓶中（每瓶5mL），培養7d見有細胞克隆形成，換液，繼續培養，常規收獲及G顯帶。制得的染色體標本在高倍鏡下計數20個分裂相，分析3～5個核型，嵌合體計數100個。

1.2.2臍靜脈穿刺 超聲引導下選取臍帶游離段抽取臍帶血1.5mL，接種于外周血淋巴細胞培養液中，接種兩瓶，每瓶0.3mL。37℃培養箱中培養72h后進行常規收獲、制片、G顯帶、染色體核型分析。

1.3分析指標[7]

所有參與本次研究的孕婦均給予隨訪，觀察所有無創DNA檢測陽性孕婦的羊水或臍靜脈穿刺染色體核型分析結果，并以此為最終結果，觀察無創DNA檢測結果的準確率。觀察不同危險分析度孕婦的無創DNA檢測結果的準確性。

危險度分級，高齡組：孕婦預產期年齡>35歲;唐氏高風險組：預產期年齡<35歲，唐氏綜合征血清學篩查提示21三體綜合征風險值≥1/270或18三體綜合征風險值≥1/350;其他高危因素組：包括唐氏臨界風險（預產期年齡<35歲，唐氏綜合征血清學篩查提示21三體綜合征風險值在1/500～1/270或18三體綜合征風險值在1/500～1/350）、唐氏血清學篩查單項指標異常、超聲軟指標異常。

1.4統計學處理

用SPSS19.0統計學數據處理軟件處理研究中所有相關數據，計量資料（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以百分數表示，采用X2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1羊水或臍靜脈穿刺診斷結果

無創DNA陽性結果的86例孕婦，均進行羊水或臍血染色體核型分析。在這86例細胞染色體核型中，57例見明顯異常，28例未見明顯異常，還有1例為Y染色體倒位。在57例異常核型中，21三體綜合征所占比例最高，占異常核型的59.6%（34/57）。21三體、18三體、13三體共43例，占異常核型的75.4%（43/57）。無創DNA提示的21、18、13三體高風險、性染色體及其它染色體異常，通過核型分析驗證，都有未見異常的情況，存在假陽性。見表1。

2.2無創DNA與產前診斷結果比較

以羊水或臍靜脈穿刺結果作為最終診斷結果，經驗證，無創DNA檢測準確率為66.28%，其中18三體檢測準確率最高，為100.00%，其次為21三體，檢測準確率分別為82.93%，13三體的檢測準確率為66.67%。無創DNA提示性染色體異常20例，經驗證，12例為性染色體異常，檢測準確率為60%。12例無創DNA結果示染色體微缺失及微重復的，均經核型分析驗證，其中8例同時行Array-CGH，結果提示2例胎兒的染色體及Array-CGH結果異常，檢測準確率為14.29%。見表2。

2.3不同危險度孕婦無創DNA陽性準確率比較

高齡組、唐氏高風險組、其它高危因素組孕婦無創DNA陽性準確率分別為62.86%、72.73%、65.52%，三組準確率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4無創陽性隨訪情況

本研究對86例無創DNA結果陽性的孕婦進行了隨訪，57例羊水染色體核型明顯異常者，引產55例，其中2例胎兒性染色體異常，核型為47，XXY及Mos45X[4]/46，XX[32]，知情理解后，孕婦拒絕引產，選擇繼續妊娠。另外，29例無創DNA假陽性結果，經染色體核型和QF-PCR確認染色體核型正常，經電話隨訪，胎兒出生后健康，未發現異常。

3 討論

無創DNA產前檢測技術是一種新型的胎兒染色體非整倍體檢測技術，僅需要采集孕婦的靜脈血，利用新一代DNA測序技術，對母體外周血漿中游離的DNA片段進行測序，將結果進行生物信息分析，以獲得胎兒的遺傳信息，以此來檢測胎兒是否患有21、18、13三體綜合征[8]。Lo等在1997年首次發現母體外周血中胎兒游離DNA的存在。并且開發一套新技術，證明了胎兒游離DNA診斷遺傳性疾病的可行性，開創了利用第二代基因測序檢測基因異常的新途徑[9-10]。

胎兒染色體非整倍體異常是臨床最常見的導致胎兒發育異常的染色體疾病。是由于親代之一的生殖細胞在發生減數分裂形成配子時，染色體未發生分離，導致了三體的發生[11]。其中以21三體綜合征最為常見，60%患兒在妊娠早期即流產，存活的患兒會出現明顯的智力落后、特殊面容以及生長發育障礙[12]。因此對于高危孕婦，進行產前篩查及診斷，可以有效避免缺陷兒的出生。但目前應用最為廣泛的孕婦血清學篩查效率低，假陰性率及假陽性率均高，存在漏診風險，而傳統的介入性產前診斷方式，屬于有創性操作，有出血、損傷胎兒的風險，甚至可能誘發流產的發生[13]。無創DNA則避免了上述風險事件的發生。無創DNA使用高度敏感的檢測方法將DNA片段進行量化，從而能較為準確地檢測出13三體綜合征、18三體綜合征、21三體綜合征。目前國際上把它作為傳統產前診斷技術的有效補充手段[14]。

從本次研究來看，以羊水或臍靜脈穿刺結果作為最終診斷結果，孕婦無創DNA結果與介入性產前診斷結果比較，無創DNA檢測準確率為66.28%，其中21三體檢測準確率為82.93%，18三體檢測準確率為100.00%，13三體、性染色體及其他染色體異常的檢測準確率分別為66.67%、60.00%、14.29%。說明無創DNA對于21、18、13三體具有較高準確率，且其對21三體綜合征、18三體綜合征的檢測準確率高于13三體、性染色體異常，因此能夠更為準確的對其進行診斷，減少了誤診和漏診的風險。高齡組、唐氏高風險組、其它高危因素組孕婦無創DNA陽性準確率分別為62.86%、72.73%、65.52%，三組準確率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。說明無創DNA對于不同風險等級的孕婦，其檢測準確率無明顯差異，因此具有很高的臨床應用價值。

本研究中，胎兒染色體異常以21三體綜合征為主，無創DNA對于胎兒染色體非整倍體異常具有較高的準確率，但無創DNA結果提示的各項高風險也存在假陽性結果，準確率并非均達99%以上。與其他學者報道是一致。據報道局限胎盤嵌合型是導致假陽性重要原因，孕婦自身染色體異常、母體實體腫瘤等、胎兒游離DNA不足等都可能導致無創結果假陽性[15-16]。本研究中18三體檢測準確率最高，為100.00%.21三體檢測準確率為82.93%，分析21三體準確率較實際臨床低的原因：病例數仍需增加;臨床中很多無創DNA結果示21三體高風險，且超聲也提示異常的，孕婦拒絕進一步產前診斷，已自行引產。由于無創DNA檢測結果假陽性的存在，無創檢測結果陽性，不能直接終止妊娠，應建議其進一步行介入性產前診斷確診。

本研究中12例無創DNA提示染色體微缺失及微重復的，產前診斷結果提示2例胎兒的染色體及Array-CGH結果異常。可見無創基因對亞顯微的染色體微缺失、微重復存在一定的檢出率。隨著測序的加深，將可能發現更多類似病例。對于無創結果懷疑染色體微缺失、微重復，建議同時行染色體核型分析及Array-CGH驗證結果。

綜上所述，無創DNA與傳統的染色體核型比較具有快速、安全無創等優點，是產前篩查21、18、13三體綜合征的有效方法，對于其它染色體異常具有重要提示意義，患者接受度高，適于臨床推廣應用。但無創DNA存在假陽性，對其他染色體疾病檢測準確性還需進一步提高。因此對于無創DNA檢測結果提示高風險的孕婦，不能直接終止妊娠，應建議其進一步行介入性產前診斷確診。

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（收稿日期：2019-04-19）