化肥減量配施有機液體肥對土壤微生物群落結構多樣性的影響

桑 文，趙亞光，張鳳華*

(石河子大學/新疆兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆 石河子 832003)

【研究意義】大量研究表明，施肥可明顯改善土壤理化性質、增加土壤肥力、提高作物產量[1-2]，但長期大量使用無機肥會破壞土壤微生物群落、降低土壤微生物的多樣性，導致微生物功能退化，從而土壤質量下降，還會導致農業污染加重[3]。為了降低化肥過度施用帶來的負面影響，通常采用有機肥代替部分化肥，已有的研究表明，與單施化肥相比，有機肥與化肥配合施用可以提高土壤有機碳水平[4]、協調土壤碳、氮庫的平衡，有利于提高土壤生產力[5]，而有機液體肥料作為一種新型水溶性肥料，與化肥配施，能夠活化土壤養分、實現高效管理養分資源，從而達到作物高產和農田環境保護[6]；這種施肥方式也將成為我國今后肥料施用的趨勢[7]。【前人研究進展】施肥是對土壤微生物環境穩定性造成人為干擾的最主要因素之一，肥料的施用量、種類都會對土壤微生物的多樣性產生影響[8]。土壤微生物是土壤中最活潑的生物體，不僅參與土壤養分轉化和釋放過程[9-10]，還在土壤生態系統的能量流動、固定肥力等方面發揮著重要作用[11-12]是評價土壤質量的一項重要指標[13]。于冰[14]等研究表明，施用有機肥能夠增加微生物多樣性；袁紅朝[15]也指出化肥配施有機物料能夠增加土壤細菌種群多樣性和數量。【本研究切入點】目前，國內外研究者在不同類型有機肥對土壤微生物的影響方面開展了大量的研究，而對化肥減量配施有機肥的土壤細菌群落結構及多樣性方面的研究較少。【擬解決的關鍵問題】因此，本研究以不同施肥處理的番茄土壤為研究對象，設置不施用化肥、單施化肥和化肥分別全量、減量10 %、減量20 %配施有機液體肥為處理，采用高通量測序技術對土壤細菌16S r RNA 進行測序，分析施用有機液體肥及適量減少化肥的施用量對土壤理化養分及細菌群落結構和多樣性的變化，探究施用有機液體肥及適量減少化肥對土壤微生態環境的影響，為化肥減量配施有機液體肥的施肥方式推廣及土壤微環境的改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究位于新疆石河子市石河子大學農試場玻璃溫室大棚內，供試土壤屬中壤土，施肥處理前 0～20 cm 土壤基礎養分含量為pH 8.18，有機質 7.25 g·kg-1，堿解氮58.63 g·kg-1， 速效磷 7.70 g·kg-1，速效鉀 101.91 g·kg-1。

1.2 試驗材料

供試作物為番茄，供試品種為里格爾87-5號，于2018年9月25號播種育苗，2018年10月27號定植，2019年5月17日開始收獲，2019年6月15日收獲完畢。供試化肥：尿素(含 N 46 %)、磷酸一銨(含 N 10 %，P2O544 %)、硫酸鉀(K2O 51 %)；有機液體肥有機質含量為 300 g/L，含N 50 g/L，P2O510 g/L，K2O 10 g/L，pH 4.7。

1.3 試驗設計

試驗設置5個處理，NF:空白對照(不施肥)；CF:單施化肥；CF100SW (化肥全量配施有機液體肥)；CF90SW(化肥減量10 %配施有機液體肥)；CF80SW(化肥減量20 %配施有機液體肥)。根據番茄需肥特性于番茄苗期施入15 %，盛花期施入25 %，盛果期施入60 %，各處理具體氮、磷、鉀養分施用量見表1。

表1 試驗處理及施肥用量

各處理重復3次，隨機區組排列，共15個小區，小區之間鋪設1 m深的隔離膜，小區面積1.6 m×5 m=8 m2，番茄采用覆膜種植，1膜2管2行配置，株距40 cm，行距60 cm，理論株數5.2×104株·hm-2。總灌水量2700 m3·hm-2，灌水8次，隨水施肥6次，每個處理均采用單獨施肥罐，其他栽培管理措施參照當地大田。

1.4 測試項目及方法

于番茄盛果期進行土壤樣品的采集，每個小區取3個點，均勻混合后裝入密封袋冷藏帶回實驗室。

將土壤樣品過 2 mm篩,去除結石和植物根部并分成 2 份。一份土壤于室內風干、研磨、過篩后裝入自封袋中, 用于土壤理化性質測定；另一部分新鮮土壤，裝入無菌塑料袋，置于-80 ℃的冰箱冰箱中存儲，用于土壤微生物的 DNA 提取和測序。

1.4.1 土壤理化性質的測定 pH采用電極電位法測定；有機質采用重鉻酸鉀容量法；堿解氮采用堿解擴散法；速效磷采用碳酸氫鈉浸提——鉬銻抗比色法；速效鉀采用醋酸銨浸提——火焰光度計法[16]。

1.4.2 土壤微生物的測定 土壤微生物多樣性測定委托北京百邁客生物科技有限公司 采用Illumina Hiseq 2500平臺對純化的合并樣品進行細菌rRNA基因的高通量測序分析。

1.5 數據處理

土壤微生物數據系統分析由北京百邁客生物科技有限公司進行。SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及多重比較，數據處理及繪圖采用EXCEL.2013 進行。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤基本理化性質的影響

由表2可以看出，各施肥處理較空白對照NF土壤pH均有所降低，CF90SW與NF處理間差異顯著，其他處理間差異不顯著；土壤有機質表現為CF90SW>CF80SW>CF100SW>CF100>NF，施用有機肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW處理有機質含量較單施化肥CF100分別增高9.62 %、30.41 %、16.62 %，CF90SW含量最高，為13.59 g/kg；土壤堿解氮表現為CF80SW>CF100SW>CF90SW>CF100>NF，施用有機肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW處理堿解氮含量較單施化肥CF100分別增高37.79 %、33.43 %、52.33 %，CF80SW含量最高，為61.13 mg/kg；土壤速效磷和速效鉀表現趨勢一致，為CF100SW>CF90SW>CF80SW>CF100>NF，CF100SW、CF90SW、CF80SW處理與CF100、NF處理間差異顯著，CF100、NF處理間差異不顯著。由以上分析可以看出，通過施用有機液體肥能夠補充和增加土壤有機質和養分，改善土壤理化性狀，提高土壤肥力。

表2 不同施肥處理0～20 cm土壤基本理化性質

2.2 不同施肥處理土壤細菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性用于分析樣品內(Within-community)的微生物群落多樣性，Shannon 指數是衡量群落多樣性的重要指標，Shannon指數越大說明群落的多樣性越高[17]，由表3可知，施用肥料的各處理土壤OTU數、Shannon 指數和Chao指數較空白對照NF均有所增加，說明施肥能夠提高土壤細菌群落多樣性；其中施用有機液體肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW處理OTU數分別為1919、1574、1361，較單施化肥CF100處理分別增高74.90 %、43.48 %、24.07 %；CF100SW、CF90SW處理Shannon 指數為6.48、6.46，較CF100處理分別增高10.86 %、10.51 %；CF100SW、CF90SW和CF80SW處理的Chao指數為1927.16，1625.12、1446.85，較CF100分別增高49.93 %、26.43 %、12.56 %，說明有機液體肥較常規化肥的施用更有利于提高土壤細菌群落的數量和均勻度，且適量減少化肥的施用CF90SW、CF80SW處理仍能夠提高土壤細菌群落多樣性。

表3 不同施肥處理土壤細菌群落多樣性指數

2.3 不同施肥處理土壤微生物群落組成分析

2.3.1 在門級別的菌落組成分析 根據各OTU中代表序列的物種注釋結果，選取各處理0～20 cm土壤樣品中細菌在門(Phylum)分類水平上最大豐度排名前 10 的物種。由圖1 可知，5 個施肥處理0～20 cm土壤中細菌在門的分類水平上，最大豐度排名前10的種類從大到小依次為: 變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、藍藻菌門(Cyanobacteria) 、綠彎菌門(Chloroflexi) 、疣微菌門(verrucomicrobia)和patescibacteria。其中變形菌門(Proteobacteria)在施用有機液體肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW處理相對豐度分別為38.52 %、43.06 %、22.50 %，較空白對照NF豐度分別增高20.69 %、25.23 %、4.67 %； CF100SW、CF90SW較單施化肥CF100豐度分別增高12.53 %、17.07 %，CF80SW降低3.49 %； CF100SW、CF90SW擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度減少，與變形菌門(Proteobacteria)呈相反的變化，較NF降低17.08 %、21.05 %，較CF100降低10.80 %、14.76 %，CF80SW較CF100豐度增高8.24 %；厚壁菌門(Firmicutes)與擬桿菌門(Bacteroidetes)變化趨勢一致；CF100SW、CF90SW、CF80SW的放線菌門(Actinobacteria)較NF和CF100豐度均有所降低；而CF100SW、CF90SW、CF80SW的酸桿菌門(Acidobacteria)則有所增加，分別為8.92 %、14.02 %、6.05 %，較NF增高4.18 %、9.28 %、1.31 %，CF100SW和CF90SW較CF100增高2.24 %、7.34 %。由以上分析可以看出，施用有機液體肥的CF100SW、CF90SW處理對優勢菌門群落結構組成影響較大。

圖1 各樣本在門水平的細菌相對豐度Fig.1 The relative abundance of bacteria from five samples at the level of phylum

2.3.2 在屬級別的菌落組成分析 由圖2可以看出，在細菌屬水平上最大豐度排名前10的有許多免培養的細菌，且施用有機肥的CF100SW和CF90SW處理與其他3個處理差異較大，表現為uncultured-bacterium-f-Muribaculaceae屬、Rumiinococcaeceae-UGG-014屬、Lachnospiraceae-NK4A136-group屬豐度較其他3個處理有所降低；uncultured-bacterium-c-Subgroup-6屬、uncultured-bacterium-f-Gemmatimonadaceae屬、Nicotiana-otophora屬、Haliangium屬豐度較其他3個處理有所增高。在NF、CF100、CF80SW處理中uncultured-bacterium-f-Muribaculaceae屬豐度最大，分別為21.08 %、14.42 %、22.56 %，其次為Rumiinococcaeceae-UGG-014屬，豐度分別為9.17 %、6.65 %、10.12 %；uncultured-bacterium-c-Subgroup-6屬和Nicotiana-otophora屬為CF100SW、CF90SW處理的主要菌屬，豐度分別為4.68 %、7.26 %和7.72 %、2.19 %。由以上分析可以看出，與門水平結果一致，施用有機液體肥的CF100SW、CF90SW處理對菌屬群落結構組成影響較大。

圖2 各樣本在屬水平的細菌相對豐度Fig.2 The relative abundance of bacteria from five samples at the level of genus

2.4 不同施肥處理土壤微生物群落結構的相似性分析

基于Beta多樣性分析得到的距離0.05的矩陣，對土壤細菌群落進行層次聚類，由圖3可知，施肥的4個處理與空白對照NF位于兩大支，說明施肥處理與不施肥處理物種組成差異較大，該4個處理中CF100SW和CF90SW處理位于一支，說明該2

圖3 不同施肥處理UPGMA聚類樹分析Fig.3 Analysis of UPGMA cluster tree by different fertilization treatments

個處理物種組成最相似，其次為CF80SW和CF100。整體來說，施用有機液體肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW的物種組成較為相似，與單施化肥CF100和空白對照NF差異較大。

2.5 微生物群落與環境因子影響之間的關系

通過對土壤微生物群落和環境因子進行RDA分析可以看出，第一主成分軸對細菌群落結構變化的解釋率為62.12 %，第二主成分軸對細菌群落結構變化的解釋率為22.14 %，總解釋率為84.26 %；有機質、速效磷和堿解氮與酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌(Gemmatimonadetes) 和綠彎菌門(Chloroflexi)呈較大的正相關性，與放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes) 和厚壁菌門(Firmicutes) 呈較大的負相關性；pH與擬桿菌門(Bacteroidetes) 和厚壁菌門(Firmicutes)呈正相關與其他菌門呈負相關，說明有機質和養分含量的增加能夠促進酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes) 和綠彎菌門(Chloroflexi)這些微生物的生長，而pH的增高則會促進擬桿菌門(Bacteroidetes) 和厚壁菌門(Firmicutes)的生長(圖4)。

圖4 土壤理化性質與細菌群落組成(門水平)的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of soil properties and bacterial community composition (at Phylum level)

3 討 論

在本研究中，施用有機液體肥后，較單施化肥處理土壤的速效養分和有機質含量增加，這可能是因為有機液體肥作為一種酸性肥料，其含有的氨基酸態氮和小分子有機酸通過螯合作用和酸溶解作用能夠促使土壤氮素轉化為更易吸收的礦化態氮[18]以及磷元素形態的轉化[19]，提高土壤中氮、磷的有效性，也能改變根際土壤pH值和氧化還原狀況[20]。土壤微生物是土壤穩定態養分轉變為有效態養分的催化劑，可敏感地反映土壤養分轉化速率與驅動力[21-22]。不同施肥處理對細菌群落結構和多樣性產生一定影響。施用有機液體肥的土壤細菌群落豐富度和均勻度較單施化肥處理有所增加；與單施化肥CF100相比，施用有機液體肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW處理的OTU數量、Shannon 指數和Chao指數均有所增高，這可能是由于有機液體肥的施入，為土壤提供了營養物質，促進微生物的大量繁殖[23-24]，因此提高了土壤中微生物的數量和多樣性，且適量減少化肥的施用(CF90SW、CF80SW)仍能提高土壤微生物的數量，陸海飛[25]，Yuan[26]等也發現，有機肥與化肥配施后能顯著增大土壤細菌的 Shannon 指數和豐度指數，Shen[27]研究也表明連續兩年施加生物有機肥后，土壤中細菌群落的多樣性顯著提高，這與本研究的結果相一致。

本研究表明，施用有機液體肥對土壤微生物活性及結構影響較大，不同施肥處理土壤細菌組成主要為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，其次為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria) 等。施用有機液體肥的CF100SW和CF90SW處理的變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度高于空白對照NF和單施化肥CF100，表明施用有機液體肥及適量減少化肥施用量能夠為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)的生長提供較好的生長環境，而CF80SW與NF、CF100處理無明顯變化，可能是由于過量減少化肥的施用量的原因，說明化肥減量20 %配施有機液體肥處理其土壤微生物環境與單施化肥較一致。趙鳳艷[28]等研究表明，施用有機肥可以增加土壤優勢菌群變形菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門等一些菌群的生長，變形菌門屬于嗜營養菌，它的許多類群與根瘤菌的共生固氮密切相關[29]，酸桿菌門也可參與腐殖質分解的碳循環過程[30]， 這些菌群的一些菌屬等均具有拮抗、促生作用[31]，在維持土壤生態系統健康中起主導作用[32]。在屬分類水平上，施用有機液體肥的CF100SW、CF90SW處理uncultured-bacterium-c-Subgroup-6屬、uncultured-bacterium-f-Gemmatimonadaceae(免培養的芽孢桿菌科屬)、Nicotiana-otophora屬、Haliangium屬豐度較空白對照NF、單施化肥CF100、化肥減量20 %的CF80SW處理增高，由于有大量未被培養出的細菌，而這些細菌功能不詳，這可能跟試驗地的土壤類型有關，也可能與所施用的有機液體肥類型有關。在微生物群落結構相似性的分析中也表明，施用有機液體肥的處理更具有群落的相似性，與空白對照和單施化肥處理差異較大，表明通過施用有機液體肥能夠改變土壤細菌菌群的結構[33]；而土壤理化性質也影響著土壤微生物群落的變化[34-35]，在本研究中，堿解氮、有機質和速效磷是影響土壤細菌門豐度的主要因素，酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與有機質、堿解氮、速效磷呈較大的正相關性，pH與擬桿菌門(Bacteroidetes)呈正相關，與放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)呈負相關；Tóth, Z[36]研究也證實，有機質含量的高低能對土壤細菌群落的結構和組成產生影響；Kim M ，Zhalnina K稱pH在 5～9 的范圍內，綠彎菌門(Chloroflexi)在土壤中的比例與pH呈顯著負相關[37-38]。因此，通過施用有機液體肥能夠增加土壤養分、提高土壤細菌群落多樣性、影響土壤微生物群落結構、進而能夠提高農田生態系統的生產力、有效維持土壤生態功能、保持土壤健康[39]。

4 結 論

施用有機液體肥對土壤速效養分及有機質含量均有所提升，具有提高土壤肥力的作用。

施用有機液體肥且適量減少化肥的施用量(10 %)能夠提高土壤微生物群落多樣性，并增高優勢菌群變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria) 豐度，改變土壤細菌菌群的結構。