基于人參果轉錄組測序的SSR和SNP特征分析

陳姝欣，朱浩東，楊夢思，陶連德，鐘啟文，楊世鵬

(青海大學農林科學院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海大學，青海 西寧 810016)

【研究意義】人參果(Solanummuricatum)又被稱為香瓜茄，是一種原產于南美洲的多年生茄科草本植物。成熟后的人參果果皮底色為玉白色或者金黃色，大部分的人參果皮上有紫色花紋，果肉金黃[1]，是一種漿果類作物，不僅可以作為一種觀賞植物，且味道清甜，無酸澀感，微量元素極其豐富，特別是硒[2]，而且富含維生素，對于其他水果而言具有相對較高的營養價值。【前人研究進展】目前國內未見人參果分子領域研究的報道，相關分子標記的研究還尚在標記開發的階段。SSR是一種微衛星序列，主要由一到六個核苷酸的重復構成[3]。其兩端的序列是兩段非常保守的序列，若將這2個側翼序列作為這段微衛星序列的引物，就可擴增出中間的重復序列，而這段微衛星序列重復單元之間的數目通常是具有較大差異的，存在著豐富的多態性[4]。SNP標記和SSR標記的區別在于SNP是指單個堿基的變異，例如堿基的缺失、轉換等。最近幾年高通量測序技術發展十分昌盛，這也使得SSR及SNP技術發展迅猛，這2種分子標記技術由于其方便快捷的特點，已經被廣泛地應用于親緣關系、指紋圖譜的構建等多個領域。【本研究切入點】我國目前僅以大果、小果、長果、圓果等對人參果進行簡單區分,命名不夠科學,且常與用特定模具進行定形后的西葫蘆人參果混淆,阻礙了人參果的推廣以及種質資源的開發。因此,分子標記的開發對于完善人參果遺傳圖譜的構建和品種分類有重要意義。【擬解決的關鍵問題】本文主要是對人參果的轉錄組通過MISA軟件[5]檢索SSR位點并用GATK[6]進行SNP的識別, 通過分析其SSR位點和SNP位點的組成和特征, 從而完善人參果的分子標記, 為今后人參果利用分子標記進行品種鑒定奠定基礎。

1 材料與過程

1.1 實驗材料

本研究實驗材料取自青海省農林科學院園藝所實驗溫室，選取室內苗齡兩年的扦插人參果苗，將未開花、正在開花、已經結果但果實未成熟、已有成熟果實設置為4個處理，采集處于不同時期的人參果苗的葉片各3份液氮冷凍，將材料放置于-80 ℃環境下保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA的提取 用Trizol法[7]提取人參果總RNA，經過電泳檢測后利用天根TGem Spectrophotomoter檢測提取的總RNA的含量是否符合轉錄組測序的標準。

1.2.2 轉錄組測序及數據組裝 提取的人參果葉片總RNA經脫氧核糖核酸酶I (DNase I )處理后,用含oligod dt的磁珠使mRNA富集、純化。利用mRNA片段化反應體系將mRNA打斷成短片段，以得到的短mRNA為模板合成1st Strand cDNA (cDNA第一鏈),再以第一鏈為模板加入合成序列所需緩沖液、無核苷酸酶水、第二鏈cDNA合成酶混合物，從而合成第二鏈，將得到的cDNA純化回收修復其粘性末端，在其3'端加上多聚(A)尾巴，且連接測序接頭。使用電泳技術對序列長度進行篩選，通過PCR擴增序列后利用Illumina Hiseq 2500精確測序平臺對所制備的文庫測序。過濾人參果葉片樣品的測序原始數據，以除去包含接頭或低質量的序列，得到干凈序列。對所有干凈序列通過Trinity(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)進行組裝拼接,將拼接得到的所有序列中最長的序列作為基因組數據庫用于后續分析。

1.2.3 SSR和SNP的獲取 對提取所得人參果總RNA進行測序得到人參果的轉錄組數據，通過利用MISA軟件搜索人參果轉錄組中的SSR位點。同時運用STAR[8]比對軟件對所得Reads和Unigene序列比對，并利用GATK的SNP識別流程[9]，識別SNP位點。

2 結果與分析

2.1 RNA質量檢測

對人參果的RNA進行提取，利用電泳對提取的RNA進行初步檢測，能明顯看到28S、18S和5.8S的條帶。繼而用TGem Spectrophotomoter檢測RNA純度，得到的RIN值均符合測序所需純度要求，且無肉眼可見的蛋白質以及其他雜質等。

2.2 轉錄組數據組裝結果及統計

通過拼接與組裝，共得到68 891條Unigene，序列總長度為53 356 976 bp，平均長度為775 bp。在200～2000 bp分布著絕大部分的序列，這個長度范圍的序列占總序列的90.84 %。隨著Unigene長度的逐漸增加，其占有數量呈梯度下降之勢，其中長度范圍在200～300 bp的序列數量居多，占總數的34.85 %，其余按占有率依次向排列是300～500、500～1000、1000～2000以及2000 bp以上序列，數量分別為24 010、16 547、12 488、9534和6312條，占所有Unigene的比例分別為34.85 %、24.02 %、18.13 %、13.84 %和9.16 %(表1)。

表1 人參果基因組數據庫長度統計結果

2.3 SSR特征分析

利用MISA軟件在68 891條Unigene中搜索到5282個SSR位點，其中完整型SSR共有4947條，而復合型SSR共有335條。完整型SSR的數量約是復合型的15倍，SSR的出現頻率為7.18 %，分布密度為1/6148 bp，即平均約6148 bp就會出現1個位點。搜索獲得的SSR序列總長度為87.963 kb (0.27 %)，SSR序列所占的比例不到整個人參果轉錄組序列的1 %。通過對搜索到的SSR進行長度統計，有60.53 %的SSR長度在10～14 bp，SSR的數量隨著長度的增加急劇下降，分布在15～19、20～29、30～49、50～100 bp的SSR分別占比26.96 %、6.47 %、2.37 %、2.35 %，只有1.33 %的SSR的長度超過100 bp(圖1)。

圖1 搜索得到的SSR長度統計結果Fig.1 SSR length statistical results

對SSR核苷酸重復次數(圖2)進行統計，其中單核苷酸重復的SSR共2908條 (58.78 %) ，雙核苷酸重復的SSR共805條 (16.27 %) ，三核苷酸重復的SSR共1184條 (23.93 %) ，四核苷酸重復的有33條(0.67 %)、五核苷酸重復的有2條(0.04 %)、六核苷酸重復的有15條 (0.30 %)。由此可見人參果的SSR基元類型中，單核苷酸占一半以上，二核、三核苷酸重復的SSR占比總和也不及單核苷酸的占比。僅有50個SSR重復基元的數量大于3。

圖2 搜索得到的SSR重復種類統計結果Fig.2 Statistical results of SSR repeat types

在單核苷酸重復類型中，A/T類型有2887個(99.28 %)，C/G類型僅有21個(0.72 %)；在二核苷酸重復類型中，有398個屬于AG/CT類型，這個數量占此重復類型總量的49.44 %，占總二核苷酸重復類型數量的一半。CG/CG類型的僅有2個，占比0.25 %，AT/AT和AC/GT分別占總量的34.14 %和16.15 %；三核苷酸重復類型共有18種，最多的是AAG/TTC數量為235個，占到總數的19.85 %，其次是AAC/TTG(113個)，最少的是CGC/GCG(16個)；四核苷酸重復有18種，最多的是AAGA/TCTT(6個)，其他種類個數均較少，1和2個的占比之和達到了58.82 %；五核苷酸重復有2種，每種分別有1個；六核苷酸重復有15種，每種的數量和五核苷酸重復一樣，也是1個。

人參果轉錄組中SSR單元重復次數主要分布區間為1～25次，在此區間內又以6～10次的重復為主，此類重復基元共有2604個(52.64 %)SSR位點，其中單核苷酸類型的SSR有1438個，占重復次數為6～10的SSR數量的55.22 %，其他類型的SSR數量趨勢隨著其核苷酸基元數量的增加而遞減；其次為11～15次的重復，共有1271個SSR位點，占總重復單元的25.69 %，單核苷酸重復類型的SSR數量為1243個，占11～15次重復的97.78 %；1～5次的重復有845個SSR位點，占SSR總數的17.08 %；16～20次的重復共有176個SSR位點，占SSR總數的3.56 %；20次以上的重復次數最少，僅有51個SSR位點，且這51個SSR均是單核苷酸的重復。由表2可見，當重復次數大于5時，SSR的基元均以單核苷酸為主，當重復次數小于5時，三核苷酸是主要的重復基元。

圖3 二核苷酸重復類型數量統計Fig.3 Statistics of dinucleotide repeat types

表2 SSR重復基元類型統計結果

2.4 SNP結果分析

對得到的68 891條序列進行了SNP位點搜索，成功搜索到315 132個SNP位點，SNP的分布密度為1/103 bp，即平均約103 bp就會出現1個SNP位點。在搜索得到的SNP位點中，屬于轉換類型的有192 575個，而屬于顛換類型的有120 621個。A/G在所有變異類型中所占的比例最高，為總量的36.01 %，C/T占總量19.24 %，位居其次。觀察可得，比例較高的2種變異類型A/G和C/T均屬于轉換類型，而剩下的4種顛換類型所占的比例均低于15 %，其中A/T占總數的13.08 %，G/T占總數的12.14 %，A/C占總數的12.14 %，C/G最少，僅占總數的7.39 %。在所占比例中，轉換類型所占的比例61.10 %顯著大于顛換類型的比例38.27 %，故人參果的SNP變異類型以轉換類型為主。

3 討論與總結

在人參果的轉錄組結果中有68 891條Unigene，其中有15 846條Unigene含有SSR位點，共有5282個SSR位點在搜索后被發現，出現頻率為7.18 %，低于油茶(33.58 %)[9]、南酸棗(25.52 %)[10]、香椿(19.91 %)[11]、云南金花茶(19.63 %)[12]、黑枸杞(18.98 %)[13]、香蕉(18.53 %)[14]、油梨(17.05 %)[15]、馬藍(16.49 %)[16]、太子參(8.87 %)[17]，比較接近于山地虎耳草的SSR位點出現頻率(7.25 %)[18]，高于馬尾松(1.06 %)[19]、洋蔥(5.10 %)[20]等植物。說明人參果的SSR出現頻率并不高。

圖4 SNP變異類型統計結果Fig.4 Statistical results of variation type of SSR

在人參果SSR基元重復類型中，單核苷酸重復(58.78 %)是人參果重復類型中占比最多的一種，比例為23.93 %的三核苷酸重復僅次于單核苷酸重復。這與瓠瓜[21]、辣椒[22]和紅松[23]類似，而與黨參[24]、野三七[25]等以二核苷酸為主要重復類型的植物不同。AG/CT在SSR二核苷酸重復類型中有398個，是數量最多的類型,其次為AT/AT(275個)，AC/GT相對而言較少，有130個,而CG/CG重復出現頻率極低，僅有2個，這與蠟梅[26]、野三七[25]和李府貢棗[27]等植物的二核苷酸重復類型結果一致，AAG/CTT是人參果轉錄組中數量最多的三核苷酸重復，這符合了雙子葉植物的普遍規律[28]。1～25次之間是SSR基元重復次數的分布范圍，以6～10次重復為主，其次為11～15次的重復，1～5次的重復有845個SSR位點，即有17.08 %的SSR單元的重復次數在1～5；16～20次的重復共有176個SSR位點，占SSR總數的3.56 %；20次以上的重復次數最少，僅有51個SSR位點，且以單核苷酸為主。這與寶巾花[29]、冬蟲夏草[3]等植物基本一致。

在測序所得的轉錄組中共找到SNP位點315 132個，其分布密度為1/103 bp。SNP位點中轉換類型有192 575(61.49 %)個，顛換類型有120 621個(38.51 %)。經對比發現轉換類型的比例(61.49 %)幾乎達到了顛換類型的比例(38.51 %)的1.6倍，故人參果SNP變異類型以轉換類型為主，這與棒腺虎耳草[30]、盾葉薯蕷[31]、青楊[32]等結果一致。A/G占的比例在所有變異類型中最高，為總量的36.01 %，其次占總量19.24 %是C/T，而剩下的4種顛換類型所占的比例均低于15 %，其中A/T占13.08 %，G/T占總數的12.14 %，A/C占總數的12.14 %，C/G最少，僅占總數的7.39 %。

人參果轉錄組中得到的SNP分子標記的發生頻率比SSR高很多，表明單核苷酸的變異在人參果的基因組中更容易發生。本次對人參果轉錄組的分析說明SSR和SNP分子標記對于研究人參果品種有一定意義，但人參果目前SSR標記出現頻率較低，數量不夠豐富，但此類SSR分子標記將對今后的人參果研究奠定強有力的基礎。