小桐子JcMAPK3基因的克隆及低溫表達分析

楊 宇，陳永坤，孔春艷，龔 明

(云南師范大學 生命科學學院/生物能源持續開發利用教育部工程研究中心/云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，云南 昆明 650500)

【研究意義】小桐子(Jatrophacurcas)又名膏桐、麻瘋樹、假花生、臭油桐等，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區，為大戟科(Euphorbiaceae)麻風樹屬植物，其種仁含油量高達40 %～60 %，桐油流動性較好，是一種極具開發價值的能源植物[1]。但由于小桐子起源于熱帶，屬于冷敏(chilling-sensitive)植物，低溫嚴重影響著小桐子植株的生長發育、種子形成及桐油產量，限制著小桐子產業發展和地域分布[2]。因此，對小桐子抗冷性的分子機理研究和遺傳育種就顯得迫切和重要。【前人研究進展】促分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯途徑由促分裂原激活蛋白激酶的激酶之激酶(MAPK kinase kinase，MAP3K或MAPKKK、MEKK)、促分裂原激活蛋白激酶的激酶(MAPK kinase, MAPKK或MAP2Ks、MKKs、MEKs)、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK或MPK、MMK)3個組分組成，通過MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化[3]。MAPK被磷酸化后繼續激活信號通路中下游特定的轉錄因子或蛋白激酶，引發相應的生理生化反應，對各類刺激做出應答[4]。研究發現，MAPK含有11個保守的蛋白激酶域，在激酶域VII和VIII之間具有TEY(絲氨酸-谷氨酸-酪氨酸；Thr-Glu-Tyr)或TDY(絲氨酸-天冬氨酸-酪氨酸；Thr-Asp-Tyr)磷酸化的基序，提供激活MAPK的蛋白質結合域。研究者們基于-TxY-結構域(Thr-x-Tyr)，并根據保守區域的特點將MAPK(MPK/MMK)家族進行分類，含TEY結構域的亞家族可以分為A、B、C三類，含TDY結構域的則歸為D類[5]。研究發現，MAPK基因在響應與適應各種生物和非生物脅迫中起著重要作用[6]。在含TEY結構的亞家族中，A類亞家族中MPK3/MPK6廣泛參與各種逆境(極端溫度、鹽、重金屬、氧化脅迫、紫外、蟲害等)響應[7-8]；B類成員參與調控非生物脅迫、激素信號途徑、細胞分裂等，如AtMPK4在水楊酸信號途徑中起負調控作用[9-10]；C類亞家族中AtMAP3K17/18-AtMKK3-AtMPK1/2/7/14途徑參與對ABA的響應[11]，PsMPK7參與抗氧化和抵御病原菌侵染[12]。目前，已在多種植物中鑒定到多個MAPK基因，煙草(Nicotianatabacum)中發現17個MAPK成員[13]，木薯(ManihotesculentaCrantz)中鑒定到21個[14]，鷹嘴豆(Cicerarietinum)中有19個[15]；通過前期研究發現，小桐子(Jatrophacurcas)有12個MAPK基因[16]。此外，在玉米[17]、葡萄[18]等植物中也鑒定到許多MAPK基因。【本研究切入點】前期研究發現，小桐子幼苗經過12 ℃低溫鍛煉后，其在1 ℃低溫脅迫下的抗冷性顯著提高[19-20]；基于高通量測序，得到了小桐子低溫鍛煉條件下的轉錄組數據，發現MAPK3為差異表達基因[21]。研究克隆了小桐子MAPK3基因，進行該基因的生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術研究JcMAPK3在小桐子不同器官中，以及在12 ℃低溫鍛煉和1 ℃低溫脅迫下的表達變化模式。【擬解決的關鍵問題】探究JcMAPK3基因在12 ℃低溫鍛煉和1 ℃低溫脅迫過程中的表達模式，為小桐子低溫關鍵基因挖掘和功能研究打下基礎，為小桐子提高抗冷性的分子育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究中使用的小桐子種子來源于云南省楚雄州元謀縣，采用前期的方法進行種子消毒和萌發[22]，挑選萌發狀態一致的小桐子種子種于花盆中，放置在人工氣候箱中[設置相對濕度(RH)75 %、光周期為(光照/黑暗)16/ 8 h、晝/夜溫度為26/20 ℃]，當小桐子幼苗培養28 d后，將長至第3片真葉的小桐子幼苗進行低溫處理和取樣。首先，分別取正常生長的小桐子幼苗的根莖葉樣品；其次，進行材料低溫處理，將長勢一致的小桐子幼苗在12和1 ℃培養箱中(RH和光周期條件同上)低溫處理3 d，分別取低溫處理6、12、24、48、72 h的樣品，液氮速凍后凍存于-80 ℃冰箱，未處理的小桐子幼苗作為對照，每個處理進行3次生物學重復。

1.2 小桐子RNA提取和反轉錄

小桐子幼苗根莖葉和不同低溫處理樣品的RNA提取使用Omega生物公司的OMEGA HP plant RNA Kit試劑盒，并對提取的RNA進行濃度測定和瓊脂糖凝膠電泳檢測，反轉錄使用寶日醫生物的反轉錄試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit)，得到的小桐子cDNA置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 JcMAPK3全長cDNA的克隆

根據JcMAPK3基因mRNA序列(GenBank登錄號：XM 012209518.2)，利用DNAMAN8軟件設計MAPK3基因擴增引物JcMAPK3-F/R(表1)。PCR擴增以小桐子cDNA為模板，按照高保真酶(TaKaRa PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase)說明書進行PCR擴增。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，進行目的DNA片段的回收和純化，再連接pGEM-T Easy載體、轉化，放置在37 ℃培養箱中過夜培養，挑取白色單菌落進行PCR驗證，送至擎科生物技術公司進行測序。

表1 JcMAPK3基因克隆及qRT-PCR引物

1.4 生物信息學分析

通過NCBI中的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找出JcMAPK3的開放閱讀框，利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析JcMAPK3蛋白的基本性質等參數，小桐子JcMAPK3蛋白的二級結構使用SOPMA軟件預測，JcMAPK3的三維結構預測則通過Phyre2軟件進行。JcMAPK3跨膜結構分析通過在線軟件TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行；JcMAPK3亞細胞定位使用ProtComp在線軟件(http://linux1.softberry.com/)；JcMAPK3蛋白保守結構域分析使用NCBI中的CDD數據庫；JcMAPK3序列磷酸化位點預測利用NetPhos3.1進行。在DNAMAN8軟件中將小桐子JcMAPK3序列與多種植物的MAPK3序列進行比對，利用MEGA X[23]進行MAPK3蛋白的親緣關系分析，構建JcMAPK3蛋白進化樹。

1.5 基因的表達分析

使用1.3測序正確后獲得的小桐子JcMAPK3序列，在IDT DNA在線網站(www.idtdna.com/)中設計JcMAPK3基因的qPCR引物JcMAPK3-RT-F和JcMAPK3-RT-R(表1)，以JcGAPDH為內參。使用Roche Lightcycler 96(Roche Diagnostics Ltd.)儀器進行小桐子JcMAPK3基因的qRT-PCR，配置qPCR反應體系20 μl，分別加入12 μl TB Green Premix Ex Taq II、上下游引物(JcMAPK3-RT-F/R)各0.9 μl，以及1.2 μl的小桐子cDNA模板，加ddH2O 5μl。qRT-PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行45個循環，3次生物學重復。使用2-ΔΔCT法[24]計算JcMAPK3基因的相對表達量，顯著性分析(P<0.05)使用SPSS軟件。

2 結果與分析

2.1 克隆得到小桐子JcMAPK3基因

以小桐子cDNA為模板，進行JcMAPK3基因編碼序列(Coding sequence, CDS)的PCR擴增，電泳檢測后得到一條為1500 bp左右的清晰條帶(圖1)，長度與預期大小相符。對該目的條帶進行切膠回收、載體連接、轉化和測序后，結果表明其包含一個1119 bp的完整開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，編碼372個氨基酸(圖2)。

1: DNA Marker DL5000；2: JcMAPK3基因1: DNA Marker DL5000; 2: JcMAPK3 gene

圖2 小桐子JcMAPK3基因CDS序列及編碼氨基酸序列Fig.2 CDS sequence and amino acid sequence of JcMAPK3 gene in J. curcas

2.2 JcMAPK3蛋白理化性質和疏水性分析

通過理化性質分析發現，JcMAPK3蛋白分子式為C1920H2985N521O551S20，總原子數為5997個，其相對分子量為42.82 kD，理論等電點pI為5.6；JcMAPK3蛋白編碼372個氨基酸，其中亮氨酸(Leu)含量最高，為10.8 %，谷氨酸(Glu)為7.3 %、異亮氨酸(Ile)為7.3 %、脯氨酸(Pro)為7.0 %、丙氨酸(Ala)為6.7 %、精氨酸(Arg)為6.5 %、天冬氨酸(Asp)為6.2 %，負電荷氨基酸殘基數為50個，正電荷氨基酸殘基數為37個；其脂肪系數為91.77；不穩定指數Ⅱ為39.25(<40)，被認定為穩定性蛋白。該蛋白的總平均疏水指數為-0.264，預測JcMAPK3為親水蛋白。

2.3 JcMAPK3蛋白二級、三級結構預測分析

通過SOPMA預測JcMAPK3蛋白的二級結構(圖3)，結果表明JcMAPK3具有大量的α-螺旋(Alpha helix)，占氨基酸殘基總數的44.35 %(含有氨基酸165個)；其次，無規則卷曲(Random coil)占氨基酸殘基總數的36.29 %(135個)；延伸鏈(Extended strand)占氨基酸殘基總數的13.44 %(50個)；β-折疊(Beta turn)占氨基酸殘基總數的5.91 %(22個)。三級結構預測也表明小桐子JcMAPK3蛋白包含大量α-螺旋和無規則卷曲(圖4)。

豎線由長及短分別為α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規則卷曲Vertical lines from long to short are Alpha helix, Extended chain, Beta turn and Random coil, respectively

圖4 小桐子JcMAPK3蛋白的三級結構Fig.4 Tertiary structure of JcMAPK3 protein in J. curcas

2.4 蛋白質亞細胞定位、保守結構域、跨膜結構預測分析

亞細胞定位預測結果顯示小桐子JcMAPK3蛋

白定位于細胞核和細胞質中。其保守結構預測結果表明(圖5)，JcMAPK3含有高度保守的STKc_TEY_MAPK結構域(含TEY基序的促分裂活化蛋白激酶_絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結構域)。磷酸化位點分析表明JcMAPK3含有8個Ser位點，9個Thr位點，7個Tyr位點。小桐子JcMAPK3蛋白跨膜結構預測結果表明該蛋白不具有跨膜結構域，也不包含跨膜螺旋。

圖5 JcMAPK3蛋白保守結構域分析Fig.5 Protein conserved domain analysis of JcMAPK3

2.5 JcMAPK3基因同源性及進化樹分析

通過NCBI Blast后發現MAPK3基因在多個物種中存在，利用DNAMAN8軟件序列比對后發現(圖6)，小桐子MAPK3氨基酸序列與大戟科橡膠樹(Heveabrasiliensis)XP_021655692.1、木薯(ManihotesculentaCrantz)XP_021610630.1序列一致性分別為94.20 %、92.47 %；與錦葵科陸地棉(Gossypiumhirsutum)NP_001314498.1序列一致性為92.47 %，與薔薇科桃(Prunuspersica)XP_007205387、甜櫻桃(Prunusavium)XP_021809182.1、月季(Rosachinensis)XP_024157102.1序列一致性分別為91.71 %、90.32 %、88.44 %，與木棉科榴蓮(Duriozibethinus)XP_022729325.1序列一致性為91.42 %，與梧桐科可可(Theobromacacao)EOY34273.1序列一致性為91.58 %，與番木瓜科番木瓜(Caricapapaya)XP_021889758.1序列一致性為89.78 %，與樺木科白樺(Betulaplatyphylla)AHY02158.1序列一致性為88.83 %，與葡萄科葡萄(Vitisvinifera)RVW56822.1序列一致性為88.62 %，與葫蘆科南瓜(Cucurbitamoschata)XP_022948699.1、黃瓜(Cucumissativus)NP_001267653.1序列一致性分別為87.63 %、90.33 %、與十字花科甘藍型油菜(Brassicanapus)NP_001303218.1、高山離子芥(Chorisporabungeana)AAV68711.1、擬南芥(Arabidopsisthaliana)XP_002875737.1序列一致性分別為87.53 %、86.14 %、85.09 %，與楊柳科毛果楊(Populustrichocarpa)XP_002298450.1序列一致性為88.95 %，與豆科蔓花生(Arachisduranensis)XP_015952347.1序列一致性為87.37 %、與茄科煙草(Nicotianaattenuata)XP_019226861.1序列一致性為84.80 %。由此可見，JcMAPK3氨基酸序列與其他物種的同源性較高，且均含有TEY結構域，這表明該基因在進化過程中高度保守(圖6)。

紅色框表示JcMAPK3含有的TEY結構域The red box indicates the TEY domain contained in JcMAPK3

利用MEGA X軟件構建進化樹，將小桐子MAPK3氨基酸序列和其它20種植物MAPK3序列進行親緣關系分析，結果(圖7)顯示，小桐子的MAPK3與大戟科的橡膠樹和木薯聚在同一分支上，親緣關系較近；與擬南芥、高山離子芥、歐洲油菜、煙草、大豆距離較遠，其親緣關系也較遠。

標尺表示遺傳距離；數值表示從1000次重復計算得到的Bootstrap百分比值The scale bar represents genetic distance；Numbers represent the bootstrap percentage values calculated from 1000 replicates

2.6 小桐子不同器官中JcMAPK3基因的表達模式

JcMAPK3基因在小桐子中不同器官表達分析結果(圖8)顯示，JcMAPK3基因在根、莖和葉中均有表達，但JcMAPK3基因在根中表達量最高，莖中次之，葉中表達量最低，根中的表達量為葉片中的17.03倍，是莖中的3.39倍，這表明JcMAPK3基因在小桐子中的表達存在顯著的器官特異性(P<0.05)。

不同英文小寫字母表示處理間水平存在差異顯著性(P<0.05)There are significant differences level between different lower-case letters (P<0.05)

2.7 低溫處理下JcMAPK3基因的表達模式

前期的研究發現，小桐子幼苗經過12 ℃低溫鍛煉后，其在1 ℃低溫脅迫下的抗冷性大幅提高[19-20]。在1 ℃低溫脅迫和12 ℃低溫鍛煉處理0、6、12、24、48、72 h后，對小桐子幼苗葉片中JcMAPK3表達量進行qRT-PCR分析，結果(圖9)顯示，在1 ℃低溫脅迫后，JcMAPK3基因出現明顯的上調表達，在72 h表達量最高，為對照(0 h)的13.5倍；在12 ℃低溫鍛煉期間，JcMAPK3基因表達量以48 h最高，為對照(0 h)的5.58倍。這些結果表明JcMAPK3可以顯著響應1 ℃低溫脅迫和12 ℃低溫鍛煉，JcMAPK3明顯受到低溫誘導表達。

同一溫度下不同英文小寫字母表示處理間水平存在差異顯著性(P<0.05)There are significant differences level between different lower-case letters at the same temperature (P<0.05)

3 討 論

MAPK級聯途徑在長期的進化過程中高度保守，MAPK連接著上游級聯反應與下游信號轉導，是細胞信號傳導過程中的關鍵蛋白激酶。通過從小桐子中克隆到JcMAPK3基因，生物信息學分析顯示JcMAPK3基因編碼372個氨基酸，相對分子量為42.82 kD，JcMAPK3蛋白在激活環上含有保守的TEY結構域，與MAPK家族的典型特征一致，說明克隆到的JcMAPK3基因屬于MAPK家族。小桐子JcMAPK3蛋白的序列與其它植物的同源性較高，進化樹分析表明小桐子JcMAPK3蛋白與橡膠樹和木薯聚在同一分支上，親緣關系較近。

低溫影響植物的生理生化代謝和生長發育過程，是限制植物生長的環境因子之一[25-26]。已有許多研究證實MAPK基因的表達受環境誘導，甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]IbMPK3和IbMPK6的激酶活性被NaCl、SA、H2O2和ABA誘導，IbMPK3/6在煙草中的瞬時表達增強了病原體的耐受性[27]。在干旱脅迫下甲基環丙烯處理后，甘蔗(SaccharumofficinarumL.)通過調控SoMAPK4的表達來維持細胞內生理生化平衡，最終抵御干旱脅迫[28]。水稻(OryzasativaL.)中OsMPK3和OsMPK6在12 ℃低溫下被激活，在轉基因植株中過表達后抗冷性增強，表明OsMPK3和OsMPK6參與調控水稻的抗寒性[29]。吳紹華等在橡膠樹中發現HbMAPK1受低溫誘導表達，與橡膠樹抵御低溫逆境有關[30]。有研究顯示，CsMAPK3參與茶樹(Camelliasinensis)的抗寒、耐鹽響應，茶樹在ABA處理、寒冷和鹽脅迫下，CsMAPK3的表達均顯著上調[31]。在前期對小桐子低溫響應的轉錄組測序結果的基礎上[21]，研究發現JcMAPK3的表達在小桐子中存在器官特異性，且JcMAPK3基因可以顯著響應12 ℃低溫鍛煉和1 ℃低溫脅迫。在1 ℃低溫脅迫72 h，小桐子JcMAPK3基因表達量最高，為對照(0 h)的13.5倍；在12 ℃處理48 h時JcMAPK3表達量最高，為對照(0 h)的5.58倍，表明JcMAPK3表達顯著，受到低溫誘導表達。研究發現，12 ℃處理下72 h時表達量下調，而1 ℃處理下48、72 h時MAPK3表達量仍然上調，1 ℃低溫脅迫72 h的JcMAPK3基因表達量是12 ℃低溫鍛煉下的3.28倍，12 ℃屬于臨界生長溫度，1 ℃對小桐子有致命的傷害，JcMAPK3對1 ℃脅迫響應更強烈，在短期內快速引發一系列的信號系統來響應和抵御低溫。

4 結 論

通過研究克隆到小桐子的MAPK家族基因，命名為JcMAPK3，其開放閱讀框為1119 bp，小桐子JcMAPK3基因在12 ℃低溫鍛煉和1 ℃低溫脅迫下受到低溫誘導表達顯著，推測JcMAPK3基因參與小桐子對低溫的響應與適應過程，在小桐子低溫信號轉導及耐冷性提高中起重要作用，這為后續的小桐子抗冷性的分子育種提供了一個重要的基因資源和理論依據。