基于SSR分子標記的柚資源遺傳多樣性分析

陳林楊，劉 萍，董蓉嬌，劉夢雨，趙東興，楊永智，趙志昆*

(1.云南省紅河熱帶農業科學研究所，云南 河口 661300；2.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；3.西南大學柑桔研究所/中國農業科學院柑桔研究所，重慶 北碚 400712)

【研究意義】柚[Citrusmaxima(Burm) Merr.]為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(CitrusreticulataBlanco)喬木，在柑橘產業中占有越來越重要的地位，而中國作為柚的主要起源和遺傳變異中心之一，雖然擁有豐富的柚類種質資源，但由于有些地方老品種面臨著分布零散并且被砍伐等嚴重的問題，導致中國柚類種質資源遺傳多樣性降低。柚作為蕓香科柑橘屬的一員，在不同的地方有內紫、雷柚等別稱。【前人研究進展】SSR分子標記技術已被用于綠豆[1]、金沙柚[2]的遺傳多樣性研究、南豐柑橘[3]種質資源親緣關系的研究、浙江地區柚[4]種類資源遺傳關系的分析，且取得良好的結果，但將其直接用于柚類資源的遺傳多樣性的研究相對較少，因此利用SSR分子標記技術對柚類資源進行遺傳多樣性分析對充分保護和利用柚資源具有重要意義。其中王炯根據前人所設計的COS引物，對柑橘近緣、遠緣屬植物進行試驗，結果表明，目標引物對柑橘屬及其近緣、遠緣屬均可以進行有效擴增及區分[5-6]。【本研究切入點】柚類雖屬于柑橘屬，但利用SSR分子標記技術直接對柚類資源進遺傳多樣性分析的研究相對較少且不夠全面。【擬解決的關鍵問題】通過SSR-PCR分子標記技術，篩選出擴增效果好、多態性較高的引物用于系譜分析，其次對SSR分子標記的多態性條帶進行統計，構建遺傳距離矩陣，獲得親緣關系聚類圖，最后對柚資源遺傳多樣性進行分析，以期為充分利用及保護云南及其他地區的柚資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試柚[Citrusmaxima(Burm) Merr.]材料共35份，紅熱青柚1號、紅熱青柚1號親本、紅熱青柚2號、紅熱青柚2號親本、紅熱青柚5號、紅熱青柚6號、紅熱青柚7號取自云南省紅河熱帶農業科學研究所，其余28份取自中國農業科學院柑桔研究所，以上材料均由云南省紅河熱帶農業科學研究所的趙志昆老師提供(表1)。

表1 用于SSR標記分析的材料

主要的試劑藥品及來源見表2。

表2 主要試劑及藥品

SSR引物來源為柑桔研究所資源與育種研究室用于柑桔品種鑒定所用的分子標記[5-9]，所用引物由深圳華大基因公司合成。

主要的儀器設備及來源見表3。

表3 主要儀器及設備

主要的溶液配制見表4。

表4 主要溶液的配制

1.2 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法提取35份供試材料的DNA，提取步驟嚴格按照說明書進行，其中用到的試劑及使用時的注意事項見表5，最終提取產物于-20 ℃保存。

表5 提取DNA所用試劑及注意事項

(1)編號：將供試柚按照不同品種編號，并在相應的離心管上寫上編號。

(2)稱量、研磨：稱取植物新組織100 mg(或干重組織30 mg)放入對應的試管中，加入液氮充分研磨，用移液槍吸取PL 600 μl，在組織回綠前加入材料中，利用振蕩器實現二者充分混合。

(3)65 ℃的水浴條件下加熱30 min，在此過程中離心管每隔10 min就需要顛倒1次，使樣品混勻并放氣。

(4)用移液槍吸取提前配制好的氯仿/異戊醇/無水乙醇700 μl，加入上一步得到的混合溶液中，持續顛倒10 min，使樣品混合均勻，13 000 r/min離心5 min，目的在于除去溶液中的多糖多酚。

(5)用移液槍吸取550 μl上清液至另一個全新的1.5 mL 離心管中，再次進行上一步驟。

(6)再次用移液槍分別吸取上清液550 μl和PQ 720 μl，在離心前用手甩2～3次，目的在于讓溶液混和均勻，保證實驗質量(此步驟有可能出現沉淀)。

(7)將上一步獲得的混合物加入另一個全新的吸附柱AC中。在離心速度不變的情況下離心30 s，結束后倒掉廢液。

(8)吸取IR500 μl，在12 000 r/min 的條件下離心30 s，結束后倒掉收集管中的廢液。

(9)加入WB 600 μl，離心條件與操作步驟與上一步相同。

(10)再重復操作上一步驟1次。

(11)將吸附柱AC放至另一個全新的空收集管中，在12 000 r/min的條件下再次離心2 min，離心結束后倒掉廢液，此步驟的目的在于除去WB中的乙醇。

(12)再次把AC放入到一個干凈的離心管中，加入EB 100 μl，靜置5 min，在離心速度不變的情況下離心1 min。

(13)在保證離心條件不變的情況下將收集管中的液體重新加入到另一個全新的、干凈的AC中，靜置2 min后進行離心，收集DNA。

(14)檢測：稱取瓊脂糖0.4 g及量取1×TBE 50 mL，兩者充分混合，配制成0.8 %的瓊脂糖膠，吸取DNA 3 μl檢測提取的DNA質量，在凝膠成像系統中觀察并拍照保存。

1.3 SSR引物合成與PCR擴增

1.3.1 引物合成: SSR為柑桔研究所資源與育種研究室用于柑桔品種鑒定所用的分子標記[5-9]，所用引物由深圳華大基因公司合成。SSR引物及其對應序列的相關信息見表6。

表6 SSR引物序列信息

1.3.2 PCR擴增體系的構建 以35份柚基因為模板，在Biometra TAdvanced PCR儀上利用51對SSR引物對其進行SSR-PCR擴增，在參考相關文獻和反復試驗后，建立了良好的SSR-PCR反應體系。

PCR擴增采用20 μl反應體系：由5 ng/μl樣品DNA、0.5UTaq(TaKaRa)DNA聚合酶、25 mmol/L的MgCl2和0.33 nmol/L的上下游引物組成，混勻后加ddH2O至20 μl。

經多次實驗后，最終確定了引物篩選實驗統一的反應條件，PCR反應條件如下：94 ℃ 5 min.94 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s; 72 ℃ 10 min;35cycles。

篩選出合適引物后，進行引物溫度梯度實驗，確定每個引物最適合的退火溫度，PCR擴增產物用8 %的Native-PAGE進行檢測，于4 ℃條件下保存。

1.3.3 8 %的Native-PAGE PCR產物用8 %的Native-PAGE檢測結束后用銀染法檢測被擴增的DNA譜帶，具體步驟如下。

(1)玻璃板、膠墊、梳子在使用前用ddH2O清洗干凈并用75 %的C2H6O擦拭；安裝電泳槽。

(2)配膠、灌膠、插梳子：灌膠速度要迅速，插梳子時避免氣泡產生，約40 min，待膠凝固后再輕拔梳子。

(3)預電泳：恒壓200V、15 min。

(4)點樣：用微量取樣器取混合物1 μl(指示劑與擴增產物)注入地點樣孔。

(5)電泳：升高電壓至250V，待溴酚藍擴散到凝膠底部時停止電泳，時間一般為1.7 h。

(6)電泳結束后，用硝酸銀進行染色。

(7)用凝膠成像系統中白光透射觀察凝膠，并拍照保存。

1.3.4 銀染色的步驟 電泳結束后，將凝膠剝下用ddH2O沖洗幾次，徹底去除凝膠表面的緩沖液。將洗干凈的凝膠放入400 mL染色液中，立刻蓋上蓋子，置于水平搖床上勻速搖10 min。用ddH2O沖洗凝膠，徹底去除殘留的染色液。倒入400 mL顯色液，水平搖床勻速搖晃直至條帶清晰。回收顯色液，自來水清洗凝膠。

1.4 數據統計與分析

用人工讀帶的方法對電泳圖的結果進行解讀，根據SSR電泳條帶的有無記錄供試柚基因型。1表示有條帶(包括弱帶), 0表示無條帶, 構建 (0, 1) 矩陣[10]。利用Genetic Distance，Coefficient = NEI 72計算35份供試材料之間的遺傳距離，通過NTsys 2.10e軟件以及遺傳距離NEI重建系統發生樹且用UPGMA算法進行聚類分析[11]。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選結果

從51對SSR引物中篩選出31對擴增效果及重復性較好、條帶清晰、多態性較高的引物用于系譜分析，31對SSR引物見表6。引物COSC4-9和引物P74的擴增效果見圖1～2。

圖1 SSR引物COSC4-9對24份(部分)實驗材料的擴增結果 Fig.1 Amplified result of 24 (partial) experimental materials by SSR primer COSC4-9

圖2 SSR引物P47對24份(部分)實驗材料的擴增結果Fig.2 Amplified result of 24 (partial) experimental materials by SSR primer P47

2.2 SSR標記的聚類分析

從圖3中可以看出，31對引物能將35份材料區分開，在相似系數為0.214時，35份植物材料被分為3大組，第1組在遺傳距離為0.25處將強德勒柚和平陽柚視為一類。第3組在遺傳距離為0.178處又分為2個亞組，其中糸島柚、高浦柚和紅熱青柚6號聚為1個小組，紅熱青柚1號、紅熱青柚1號親本、紅熱青柚2號、紅熱青柚2號親本、紅熱青柚5號聚為1個小組。剩余材料均聚在第2組，第2組在0.166處又分為2個亞組，其中紅熱青柚7號與勐侖早柚、越南小甜柚、金蘭柚歸為1個小組。從聚類分析結果可以看出，紅熱青柚1號、紅熱青柚1號親本、紅熱青柚2號、紅熱青柚2號親本、紅熱青柚5號之間親緣關系較近，其中紅熱青柚1號、紅熱青柚2號親本與紅熱青柚1號、紅熱青柚2號的親緣關系更為接近，紅熱青柚1號、紅熱青柚2號之間的遺傳差異非常小。

圖3 35份植物材料SSR標記UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA cluster map of 35 plant materials with SSR markers

3 討 論

3.1 SSR對柚資源的研究

SSR由于具有可快速鑒別品種真實性和純度且其不受環境對植物形態的影響，可以從分子水平上區分不同品種間的遺傳距離，十分穩定可靠，被認為是一種理想的遺傳多樣性分析技術[12-13]。李益[7]等人對柑橘屬的8個主要栽培種進行SSR分子標記，篩選出21對SSR核心引物，成功建立了柑橘品種SSR分子標記鑒定體系；劉冬峰[4]等人利用23對SSR引物對浙江地方柚類進行分析，表明該地區種質資源有豐富的遺傳多樣性，并構建了浙江地方柚類資源的種質鑒定圖；以上均表明SSR分子標記已被廣泛用于柑橘屬遺傳多樣性的研究，雖然柚屬于柑橘屬，但基于SSR分子標記技術直接對柚類資源進遺傳多樣性分析的研究相對較少，且用其對柑橘屬所進行的遺傳多樣性的分析具有一定的地域限制以及品種單一等缺點[4]，因此利用SSR分子標記技術對柚類資源進行遺傳多樣性分析對于柚類資源的保護和充分利用具有重要意義。

3.2 供試柚之間的親緣關系

利用NTsys 2.10e軟件對35份供試材料進行聚類分析，對其遺傳多樣性水平作出一定的評價，聚類結果與系譜來源具有較高的關聯，在相似系數為0.214時35份植物材料被分為3大組。35份供試柚的遺傳相似系數矩陣和聚類結果最終結果表明，35份供試品種之間的遺傳相似系數的變化在0.00～0.25，平均為0.125，遺傳相似系數偏低，表明35份供試材料之間的遺傳水平較寬。此外，在第3組中，紅熱青柚1號和紅熱青柚2號親緣關系很近，用引物無法將其區分開；在第2組中，泰國柚和梅州沙田柚、金蘭柚和紅熱青柚7號、綠柚和白肉泡果、翡紅柚和愛柚-1、光皮柚和囊內柚、琯溪蜜柚和曼賽龍柚、樟江紅柚和墊江紅心柚、越南小柚和夏沙龍柚(淺紅)能夠較好的聚在一起。

35份供試柚的遺傳相似系數矩陣和聚類結果表明，供試柚之間遺傳多樣性水平較高，說明品種之間遺傳背景差異大，遺傳基礎相對較寬，總體上遺傳多樣性比較豐富。

4 結 論

以35份來自不同地方的柚為材料，從51對SSR候選引物中共挑選出31對多態性高、穩定性好、條帶清晰的引物。這些SSR核心引物對35份供試柚具有良好的區分能力，通過31對多態性引物組合將35份供試柚聚為3大組，遺傳多樣性較寬。通過對其遺傳多樣性的分析，可為今后柚資源保護和品種鑒定奠定理論依據。