狹葉柴胡β-amyrin合成酶基因的克隆及其蛋白的生物信息學分析

劉艷玲，向鳳寧

(1.德州學院醫藥與護理學院，山東 德州 253023；2.山東大學生命科學院植物細胞工程與種質創新教育部重點實驗室，山東 青島 266237)

【研究意義】通過克隆植物代謝通路上某一關鍵酶基因并對其蛋白進行生物信息學分析可為該代謝途徑的調控機理提供一定的理論依據。【前人研究進展】狹葉柴胡(Bupleurumscorzonerifolium)系傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum)多年生草本植物，主要分布于我國東北、華北、西北、江蘇、四川等地[1-2]。《中國藥典》2015年版中規定狹葉柴胡的干燥根為藥材柴胡[3]，主要成分為柴胡皂甙、甾醇、揮發油和多糖，其中柴胡皂甙類化合物含量較高，柴胡皂苷d (SSd) 的藥理活性最強[4]。現代藥理學研究表明狹葉柴胡具有鎮痛、鎮靜、抗病毒、調節免疫、降血脂等功效[5-6]，已廣泛應用于腎病、肝纖維化、腫瘤等疾病的治療，并取得了顯著療效，其中尤以保肝作用效果最佳，這也與傳統中醫記載柴胡疏肝解郁功效一致[7]。柴胡皂甙d結構為五環三萜齊墩果烷型，β-amyrin 合成酶是齊墩果酸合成的關鍵酶之一，屬于氧化角鯊烯環化酶(OSCs)家族[8-10]。目前已從人參[11]、豌豆[12]、甘草[13]、白樺[14]、擬南芥[15]等多種植物中成功克隆得到編碼β-amyrin合成酶的cDNA序列，但尚未見狹葉柴胡 β-amyrin合成酶基因克隆及其生物信息學分析的報道。【本研究切入點】本研究中，首先克隆獲得狹葉柴胡 β-amyrin 合成酶基因的全長序列，然后采用生物信息學方法，對該基因結構、蛋白質理化特性、空間結構、磷酸化位點、亞細胞定位等進行預測和分析。【擬解決的關鍵問題】有望為齊墩果烷型代謝產物及代謝途徑的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗材料狹葉柴胡采自內蒙古。

1.2 試劑

DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、Olig(dT)12-18、5×M-MLV reverse transcriptase Buffer、10 mM each dNTPs、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNaseI(4 U/μl)、限制性內切酶、T4DNA 連接酶、Solution I、pMD18-T載體等購自TaKaRa公司；TRIZOL、DEPC、瓊脂糖、LB培養基等購自上海生物工程技術服務有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 BsAS全長序列擴增 (1) BsAS基因中間片段的擴增。正向引物 P1: 5’-TGGCTTTCGATA(T)CTTGGA-3’;反向引物 P2：5′-CCACCG(A)TTTTTG(A)CTCTGTA-3’。

(2)BsAS基因5’端片段的擴增。采用20 μl PCR體系，首先P3與P4進行擴增，將PCR產物取0.2 μl為模板進行P4與P6的擴增，再將二次PCR產物取0.2 μl為模板進行P5與P6的擴增。

5′半套式PCR反向引物。P3: 5′-TGACGGCGTCATACATTTTC-3′；P4: 5′-CTCAACCCAACAAGCAA GC-3′；P5: 5′-TTTCATCTTCATAATGTATATG-3′。正向引物。P6: 5′-ATGTGGARGCTDAAGATHG-3′。

(3)BsAS基因3’端片段的擴增。采用3’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法進行擴增，參照Clonetech, SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南進行。正向引物為P7：TCTTACTATCATTACAGAGCA；反向引物為3’RACE試劑盒中自帶。

(4)BsAS全長基因的擴增。正向引物P8：5′-ATCCGAAAGGAGACTATTTCA AG-3′；正向引物P9：5′- TTAAAGAGTAGTGGAAGGCA A-3′；擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min， 60 ℃ 2.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。

以上引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成，測序由博尚生物公司完成，核苷酸及蛋白質序列比對分析利用DNAMAN軟件中的比對程序進行。

1.3.2 BsAS序列生物信息學分析 使用ExPASy的ProParam在線數據庫對狹葉柴胡BsAS序列進行理化性質的預測分析；應用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具對狹葉柴胡BsAS序列進行跨膜結構的預測分析；利用PSORT Ⅱ軟件對狹葉柴胡BsAS蛋白進行亞細胞定位；利用Conserved Domains Search 網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)對狹葉柴胡BsAS氨基酸進行保守域分析；采用 SOPMA 在線工具預測狹葉柴胡BsAS蛋白質二級結構；使用Swi-ssModel 網站(https://www.swissmodel.expasy.org/)中的在線數據庫構建狹葉柴胡BsAS 蛋白質三級結構；應用NetPhos3.1 server在線軟件對狹葉柴胡BsAS序列的磷酸化位點進行預測應用MEGA6.0對狹葉柴胡進行系統進化樹的分析。

2 結果與分析

2.1 狹葉柴胡中β-amyrin合成酶基因BsAS的克隆

首先從Genebank中下載甘草、豌豆、人參、白樺的β-amyrin合成酶基因序列，設計簡并引物P1、P2，在狹葉柴胡cDNA中進行擴增，獲得約900 bp的一條片段，經測序、序列比對確定為β-amyrin合成酶基因片段。然后5’片段使用半套式PCR方法，3’片段使用RACE方法進行擴增，最后通過引物P8和P9進行基因全長的克隆(圖1)，經BLAST分析，結果表明，該基因編碼β-amyrin合成酶，全長2289 bp，共編碼762 aa，命名為BsAS(β-amyrin synthase gene)。BsAS的核苷酸及氨基酸序列見圖2。

1:中間片段擴增，2:5’片段擴增，3: 3’片段擴增，BsAS:全長cDNA擴增1: Intermediate fragment amplification，2: 5’fragment amplification，3: 3’fragment amplification，BsAS:Full-length cDNA amplification

圖2 BsAs核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Sequence of BsAs nucletide and aiminoacids

2.2 狹葉柴胡BsAS基因生物信息學分析

2.2.1 BsAS保守序列分析 研究表明，氧化鯊烯環化酶家族蛋白具有高度保守的DCTAE、QW和MWCYCR 3個序列。通過序列分析，發現BsAS中含有4個拷貝的QW序列、1個DCTAE序列和1個MWCYCR序列(圖3)。

a.QW閱讀框架；b.PCTAE閱讀框架；c.MWCYCR閱讀框架

利用Conserved Domains Search 網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)對狹葉柴胡BsAS氨基酸進行保守域分析，發現狹葉柴胡BsAS序列的1～758 位氨基酸是它的功能區域，注釋為Camelliol C合酶，該酶屬于氧化鯊烯環化酶家族 (圖4)。

圖4 狹葉柴胡BsAS氨基酸保守區分析Fig.4 Conserved domain prediction of B. scoronerifolium BsAS amino acid

2.2.2 狹葉柴胡BsAS理化性質分析 使用ExPASy的ProParam在線數據庫對狹葉柴胡BsAS序列進行理化性質的預測分析。推測BsAS序列的分子式為C3955H5944N1046O1112S48，分子量為87.47592 kDa， pI為6.04，帶負電殘基(Asp + Glu)為90，帶正電殘基(Arg + Lys) 為75，蛋白的不穩定系數為50.25，屬于不穩定蛋白；脂肪系數為74.79，BsAS蛋白的親水性平均系數為-0.357，為親水性蛋白。

使用 ExPASy 的在線分析工具 Protscale 對狹葉柴胡BsAS 蛋白的親疏水性做進一步預測(圖5)，結果表明：狹葉柴胡BsAS氨基酸多肽鏈的親水性最小值為-2.811，最大值為2.644；BsAS中親水性氨基酸所占比例較大，疏水性氨基酸所占比例較小，其結果與ProParam軟件預測相一致。

圖5 狹葉柴胡BsAS的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of B. scorzonerifolium BsAS

2.2.3 狹葉柴胡BsAS跨膜區、亞細胞定位分析 應用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具對狹葉柴胡BsAS序列進行跨膜結構的預測分析，結果顯示該蛋白沒有跨膜螺旋區(圖6)。

圖6 狹葉柴胡BsAS序列跨膜區域預測Fig.6 Transmembrane domain prediction of B. scorzonerifolium BsAS

利用PSORT Ⅱ軟件對狹葉柴胡BsAS蛋白進行亞細胞定位，發現狹葉柴胡BsAS蛋白有39.1 %位于細胞質中，26.1 %位于線粒體上，17.4 %位于細胞核內，4.3 %位于內質網中，4.3 %位于分泌系統的囊泡中，4.3 %位于過氧化體，其余4.3 %位于高爾基體，表明狹葉柴胡BsAS蛋白主要存在于細胞質中。

2.2.4 狹葉柴胡BsAS二級結構預測 采用SOPMA在線工具預測狹葉柴胡BsAS蛋白質二級結構(圖7)，狹葉柴胡BsAS蛋白二級結構的氨基酸序列中α-螺旋(Hh)為45.14 %，β-轉角(Tt)為7.35 %，無規卷曲(Cc)為 34.38 %，延伸鏈(Ee)為13.12 %。從組成數據可以看出，該蛋白二級結構的主要元件為α-螺旋和無規則卷曲，β-轉角只在局部出現。

圖7 狹葉柴胡BsAS二級結構預測Fig.7 Prediction of secondary structure of B. scoronerifolium BsAS

2.2.5 狹葉柴胡BsAS三級結構預測 使用Swi-ssModel 網站(https://www.swissmodel.expasy.org/)中的在線數據庫構建狹葉柴胡BsAS 蛋白質三級結構(圖8)，該模型的全球性模型質量估測(global model quality estimation, GMQE)得分為0.71，在0～1之間，較接近1，由此確定狹葉柴胡BsAS三級結構建模結果可靠。

圖8 狹葉柴胡BsAS三級結構預測Fig.8 Prediction of tertiary structure of B. scoronerifolium BsAS

2.2.6 狹葉柴胡BsAS磷酸化位點預測 應用NetPhos3.1 server在線軟件對狹葉柴胡BsAS序列的磷酸化位點進行預測(圖9，表1)，結果發現該序列有多個磷酸化位點，但僅有23個絲氨酸、14個蘇氨酸、16 個酪氨酸的磷酸化能力超過了閾值，表明狹葉柴胡BsAS只有53個磷酸化位點。其主要的磷酸化位點是蛋白激酶C(PKC)位點、酪蛋白激酶П(CKП)位點和細胞周期蛋白質依賴性激酶(cdc2)位點。

表1 狹葉柴胡BsAS 磷酸化位點列表

圖9 狹葉柴胡BsAS磷酸化位點預測Fig.9 Phosphorylation sites prediction of B. scoronerifolium BsAS

3 討 論

通過對BsAS基因序列分析發現，該基因含有氧化鯊烯家族特有的3個保守基序DCTAE、QW和MWCYCR。序列DCTAE與底物結合有關；QW序列帶負電荷，在 2，3-氧化鯊烯的環化過程中作用于正電荷中間體，達到穩固蛋白質結構的作用；MWCRCY 序列中的色氨酸(W)參與調控三萜化合物碳骨架的生物合成。

通過生物信息在線工具預測狹葉柴胡BsAS 蛋白是親水蛋白，無跨膜螺旋區，主要在細胞質內發揮生物學作用。蛋白質的磷酸化修飾與多種生物學過程密切相關，20世紀50年代以來一直被生物學家看作是一種動態的生物調節過程。狹葉柴胡BsAS蛋白質含有 53個磷酸化位點，其中最多的磷酸位點是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶C(PKC)。在過去30多年間，PKC家族已被廣泛研究，一致認為PKC與多種細胞過程有關，包括腫瘤的形成。研究表明，PKC與腫瘤產生的佛波醇酯相關，其受體會結合并激活PKC，從而導致腫瘤細胞生長加速。因此，醫學上一直將PKC作為抑制腫瘤的靶目標[16]。直到2015年，Antal推翻了該理論，認為PKC不但不會產生腫瘤，反而會抑制腫瘤的生長。他首先在結腸癌細胞的基因組中校正了一個功能缺失的PKC突變，然后發現該PKC能抑制小鼠腫瘤的生長，而當PKC失效時，致癌信號增加，腫瘤生長加速，但長期反復處理細胞，PKC長期高表達，則可能導致細胞內部的反饋抑制效應，導致PKC的突變或降解，從而促進了腫瘤的發生[17]。本研究中，狹葉柴胡BsAS蛋白的PKC磷酸化位點較多，可通過磷酸化激活PKC的活性，從而抑制腫瘤產生與發展，這也與柴胡具有抗腫瘤的性質相一致。

4 結 論

本研究通過基因克隆獲得了長度2289 bp的β-amyrin合成酶基因，其蛋白命名為BsAS，含有氧化鯊烯環化酶家族所特有的高度保守的DCTAE、QW和MWCYCR開放閱讀框架；BsAS無跨膜區，為親水性蛋白，定位于細胞質中；其二級結構主要是α-螺旋和無規卷曲，三級結構預測結果可信；共有 53個磷酸化位點，以絲氨酸磷酸化位點最多。BsAS全長基因的克隆和序列分析為狹葉柴胡BsAS基因結構與功能研究提供了基礎，并可為研究狹葉柴胡三萜合成通路的調節方式提供新的認識。