泗陽縣水生動物致病性病原菌對藥物感受性試驗(yàn)及結(jié)果分析

陳瑜，李勇，李曉麗

（1.泗陽縣三莊鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 泗陽 223700；2.泗陽縣水產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 泗陽 223700）

泗陽縣地處洪澤湖岸邊，近年來內(nèi)塘漁業(yè)放養(yǎng)密度、飼料投喂越來越大，呈數(shù)量型、規(guī)模型發(fā)展態(tài)勢，結(jié)果雖提高了產(chǎn)量，卻惡化了水質(zhì)，導(dǎo)致病害頻發(fā)，其耗水量、用藥量倍增，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成極大風(fēng)險。由此，倡導(dǎo)“提質(zhì)增效、減量增收、綠色發(fā)展、保護(hù)資源”漁業(yè)方向。2018年4—11月，作者對泗陽縣域內(nèi)水產(chǎn)主要養(yǎng)殖品種進(jìn)行了疫病監(jiān)測，并對其感染致病性菌株形態(tài)、生理生化特征、藥物敏感性試驗(yàn)等進(jìn)行了研究，為區(qū)域內(nèi)細(xì)菌性疾病的病原分析和防控提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

來自泗陽縣盧集鎮(zhèn)、穿城鎮(zhèn)、三莊鄉(xiāng)、史集街道辦、城廂街道辦、愛園鎮(zhèn)等漁場的多個發(fā)病養(yǎng)殖塘口，采集活力差、表皮充血、肛門紅腫、黑頭、溜邊等瀕臨死亡的水產(chǎn)樣品。

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂購于北京陸橋。腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）（API 20E）購于上海某公司，動物用藥敏分析試劑板購于南京某公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 樣品先用酒精棉擦拭，用滅菌的鑷子和剪刀取適量病變組織、內(nèi)臟、血液、鰓等放于營養(yǎng)湯，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。在無菌條件下，用滅菌的接種環(huán)取培養(yǎng)液劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個菌落劃線接種在TCBS培養(yǎng)基和脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，分別置于37℃和28℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 API試劑條微生物鑒定 用滅菌吸管挑取單個菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，將5 mL無菌水放進(jìn)培養(yǎng)盒里，將試劑條放進(jìn)培養(yǎng)盒內(nèi)，將菌液接種充滿小管或小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用礦物油覆蓋制定的生化孔（有劃線的孔）、和，形成厭氧環(huán)境。蓋上培養(yǎng)盒，于（36±2）℃孵育 18～24 h，同時做氧化酶試驗(yàn)構(gòu)成第21個試驗(yàn)。孵育后根據(jù)判讀表判斷反應(yīng)結(jié)果，參照生化譜手冊，得到鑒定結(jié)果，同時參照NCCLs和CLSI標(biāo)準(zhǔn)對藥物的敏感性及耐藥性進(jìn)行判斷。

1.2.3 病原菌的藥敏試驗(yàn) 該試驗(yàn)分別對30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌進(jìn)行了抗菌素感受性試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟：挑取純化后的單個菌落于5 mL生理鹽水中，制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙褐瞥葾管；取2支10 mL的無菌生理鹽水，打開任意一瓶，以無菌的方式向陰性對照孔分別加入200 uL的無菌生理鹽水；從A管中吸取200 uL菌懸液加入到打開的10 mL無菌生理鹽水中制成B管。將B管所有菌液倒入到經(jīng)滅菌的V形槽中，再將另一支10 mL無菌生理鹽水倒入V形槽中。混均后，利用微量移液器吸取V形槽中的菌液加入到藥敏板所有試驗(yàn)孔中（陰性對照除外）200 μL；將加樣好的藥敏分析試劑板放入35℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，孔內(nèi)液體渾濁為陽性（＋），孔內(nèi)液體澄清為陰性（-），最低藥物濃度即藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 具體的采樣地點(diǎn)、品種和數(shù)量

2018年4—11月在全縣的13個養(yǎng)殖場塘口抽檢76個樣品，其中河蟹31個，草魚29個，鯽魚11個，小龍蝦5個。如表1所示。

2.2 病原菌的分離及形態(tài)特征觀察

分離的出的嗜水氣單胞菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂上為圓形、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、微凸、微白色至淺米色菌落，在大部分脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明的溶蛋白圈；副溶血弧菌在TCBS上成圓形、半透明、表面光滑的綠色或藍(lán)綠色菌落。革蘭氏染色陰性（-）。

表1病原微生物檢測采樣品種和數(shù)量匯總表

2.3 API試劑條病原微生物鑒定結(jié)果

76個樣品分離出60個菌株，陽性檢測率78.95%。分別確定嗜水氣單胞菌45株，陽性檢出率的59.2%，副溶血弧菌3株，陽性檢出率的3.95%，氣味沙雷氏菌3株，陽性檢出率的5.26%(表2)。還有未在表中列出的草魚中檢測出的土生拉烏爾菌、紫色色桿菌、腦膜膿毒性金黃桿菌各1株，河蟹中檢出的阪崎腸桿菌、創(chuàng)傷弧菌、枸櫞酸桿菌、布式檸檬酸桿菌、霍氏格里蒙菌各1株，共8株，陽性檢測率10.5%。16株未知菌株。

表2常見的水產(chǎn)病原細(xì)菌陽性檢測結(jié)果匯總表

2.4 菌株對藥物感受性試驗(yàn)結(jié)果

30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌對8種抗菌藥物的感受性測定結(jié)果分別如表 3、表 4、表 5、表 6、表 7、表 8所示。

表3各種抗菌藥物對致病性嗜水氣單胞菌最小抑菌濃度（MIC值）

表4 30株致病性嗜水氣單胞菌對抗菌素感受性判定結(jié)果

表5各種抗菌藥物對副溶血弧菌最小抑菌濃度（MIC值）

表6 3株副溶血弧菌對抗菌素感受性判定結(jié)果

表7各種抗菌藥物對氣味沙雷氏菌最小抑菌濃度（MIC值）

表8 3株氣味沙雷氏菌對抗菌素感受性

3 討論與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采樣分離到的的病原菌對不同抗菌素藥物表現(xiàn)出了不同程度的感受性和耐藥性。

30株嗜水氣單胞菌對硫酸新霉素最敏感，敏感菌株率為100%，其次對氟苯尼考、乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星和強(qiáng)力霉素敏感菌株率分別為96.7%、93.3%、90%和83.3%。但對紅霉素最不敏感，耐藥菌株率達(dá)93.3%，其次是甲砜霉素，耐藥菌株率達(dá)83.3%。因此，建議在該區(qū)域內(nèi)對嗜水氣單胞菌引發(fā)的疫病可選硫酸新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和強(qiáng)力霉素。

3株副溶血弧菌均分離于河蟹肝胰腺中，說明副溶血弧菌主要感染河蟹，通過藥物感受性試驗(yàn)結(jié)果來看，該菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、乳酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素和強(qiáng)力霉素都敏感，敏感率達(dá)100%。通過流行性病學(xué)調(diào)查分析，這與當(dāng)?shù)爻尚佛B(yǎng)殖過程中較少使用抗菌藥物相關(guān)聯(lián)，當(dāng)?shù)爻尚穼Υ蠖鄶?shù)抗菌藥物有較好的敏感性。而對甲砜霉素耐藥菌株達(dá)100%，經(jīng)過調(diào)查，這可能是由于當(dāng)?shù)厥畮准茵B(yǎng)蟹戶曾從同一苗種場購買扣蟹，而該苗種場多次使用甲砜霉素有關(guān)。對紅霉素的耐藥菌株達(dá)66.7%，經(jīng)調(diào)查，這些塘口都有次數(shù)不等地使用過含紅霉素成分的藍(lán)藻藥殺藍(lán)藻的經(jīng)歷，造成了菌株對紅霉素產(chǎn)生耐藥性，得引起相關(guān)部門足夠重視。

在草魚、龍蝦和螃蟹中均分離出氣味沙雷氏菌，該菌是一種廣譜菌。油鏡觀測革蘭氏染色陰性（-），菌體桿狀。藥物感受性試驗(yàn)得出，該菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、乳酸環(huán)丙沙星敏感菌株達(dá)100%，對紅霉素不敏感，耐藥菌株達(dá)100%，其次是甲砜霉素也不敏感，耐藥菌株達(dá)66.7%。這可能也與使用過含紅霉素成分的藍(lán)藻藥殺藍(lán)藻的經(jīng)歷有關(guān)。

試驗(yàn)用30株致病性嗜水氣單胞菌、3株副溶血弧菌和3株氣味沙雷氏菌對8種抗菌藥物進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，顯示該區(qū)域養(yǎng)殖水產(chǎn)品對大多數(shù)抗菌藥物均有較高敏感性，但也對極個別藥物產(chǎn)生強(qiáng)耐藥。此結(jié)論對精準(zhǔn)選用抗菌藥物具有一定的參考價值。