南美白對蝦病原性豚鼠氣單胞菌的分離與藥敏特性

曾憲凱，曹海鵬，穆春華

（1.上海市青浦區(qū)練塘鎮(zhèn)農業(yè)綜合服務中心，上海鵬豪水產專業(yè)合作社，上海 201715；2.上海海洋大學農業(yè)部淡水水產種質資源重點實驗室，上海市水產養(yǎng)殖工程技術研究中心，上海高校知識服務平臺上海海洋大學水產動物遺傳育種中心（ZF1206），上海 201306）

南美白對蝦（Penaeus vannamei）是我國重要特種水產養(yǎng)殖品種，在浙江、廣西、海南、福建、山東、珠三角、長三角、京津唐等地區(qū)大面積養(yǎng)殖[1]，是我國養(yǎng)殖產量最高的對蝦養(yǎng)殖品種。2017年，我國南美白對蝦養(yǎng)殖產量高達160多萬噸[2]。然而，細菌性病害對南美白對蝦養(yǎng)殖產生了嚴重危害，其病原菌種類廣、繁殖速度快、致病力強、發(fā)病率高，通常引起南美白對蝦內臟組織出現不同程度損傷而使其大規(guī)模死亡。其中，以“附肢或游泳足變黃”為典型病癥的黃腿病是南美白對蝦養(yǎng)殖過程中的常見病之一[3-4]，但從現有文獻資料來看，南美白對蝦黃腿病的研究基礎薄弱，鮮見南美白對蝦黃腿病病原菌豚鼠氣單胞菌及其防控藥物等方面的詳細研究報道，這在一定程度上影響了我國對南美白對蝦黃腿病的有效防控。因此，加強黃腿病研究對促進南美白對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。2018年7月，上海市青浦區(qū)一養(yǎng)殖場的南美白對蝦出現了黃腿病，病死率達到了60%以上，在上海南美白對蝦養(yǎng)殖區(qū)發(fā)生實為罕見。鑒此，該試驗通過對南美白對蝦黃腿病病原菌的分離鑒定與藥敏特性研究，以期為確定南美白對蝦黃腿病的病因與藥物防控提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 材料

自然發(fā)病南美白對蝦，16尾，平均體質量5.12 g，取自上海市青浦區(qū)自然發(fā)病養(yǎng)殖池；健康南美白對蝦，60尾，大小均勻，體質健壯，平均體質量8.72 g，由浙江蕭山某養(yǎng)殖場提供；API ID32GN細菌生化鑒定試劑條，由法國某公司生產；藥敏紙片，由杭州某微生物試劑有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 采用75%酒精對具有典型發(fā)病癥狀的瀕死南美白對蝦進行表面消毒后，參照Cao等[4]的方法常規(guī)無菌操作取其肝胰腺組織，劃線普通營養(yǎng)瓊脂平板進行病原菌的分離，30℃恒溫培養(yǎng)24～32 h后純化分離菌株，并轉接至普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上于30℃恒溫培養(yǎng)32 h，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌株的人工回歸感染試驗 試驗包括3個試驗組和1個對照組，每組各15尾健康南美白對蝦。試驗前用無菌生理鹽水分別洗下普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上各分離菌株的菌苔制成菌濃度為1.0×106CFU/mL的菌懸液。試驗組南美白對蝦分別在靠近尾扇第3腹節(jié)處[5]注射濃度為1.0×106CFU/mL的分離菌株菌懸液，每尾注射0.1 mL；對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水。試驗周期為6 d，試驗期間水溫控制在28℃，每天記錄試驗南美白對蝦的死亡數量，觀察其病癥，并將死蝦及時撈出進行病原菌的再分離，確定其與原病原菌株的一致性。

1.2.3 病原菌的鑒定 參照曹海鵬等[6]的方法，用API ID32GN細菌鑒定系統對病原菌株進行生理生化鑒定，并委托上海某生物科技有限公司對病原菌株進行PCR擴增與測序后，采用鄰接法構建系統發(fā)育樹，通過16S rRNA序列分析對病原菌株進行分子鑒定。

1.2.4 病原菌藥敏特性的測定 參照紙片擴散法[7]測定病原菌株的藥敏特性，并根據杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準》，判定病原菌株對抗生素的敏感性。

2 結果

2.1 病原菌的分離

從自然發(fā)病的南美白對蝦的肝胰腺組織中分離到3株疑似病原菌株，暫命名為QPX1、QPX2、QPX3。人工回歸感染試驗結果（表1）表明，僅菌株QPX1感染南美白對蝦后南美白對蝦出現了死亡，試驗南美白對蝦的病死率達到了100%，而且試驗南美白對蝦的病癥與自然病癥基本相同，并從人工感染的病蝦肝胰腺中又可再次分離到與原菌株生理生化特性一致的菌株，由此判定菌株QPX1是引起該病的病原菌。

表1 分離菌株對南美白對蝦人工回歸感染試驗結果

2.2 病原菌的鑒定

菌株QPX1的生理生化鑒定結果表明(表2)，菌株QPX1為豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae），與豚鼠氣單胞菌對照菌株[6，8]生理生化特性有96.9%的一致性。此外，通過NCBI網站中的BLASTN軟件將菌株QPX1的16S rRNA基因序列（GenBank收錄號：MK652096）與GenBank中已知菌株的16S rRNA基因序列進行了同源性比較（表3），發(fā)現菌株QPX1的16 S rRNA基因序列與GenBank中豚鼠氣單胞菌菌株的16 S rRNA序列自然聚類，同源性達到了99%～100%。通過鄰接法構建的基于菌株QPX1 16S rRNA基因序列的系統發(fā)育分析（圖1）進一步表明，菌株QPX1與豚鼠氣單胞菌菌株J2（GenBank收錄號：KP262414）的親緣關系最近。結合生理生化鑒定以及16S rRNA基因序列分析的結果，判定QPX1為豚鼠氣單胞菌。

表2 菌株QPX1的生理生化特征

注：＋，陽性；－，陰性；d，存在種間差異。

表3 菌株QPX1的16 S rRNA基因序列與GenBank中已知豚鼠氣單胞菌菌株16 S rRNA基因序列同源性

2.3 病原菌的藥敏特性

菌株QPX1對14種抗生素的敏感試驗結果（表4）表明，菌株QPX1對阿莫西林、多粘菌素B、磺胺異噁唑、復方新諾明、卡那霉素、吡哌酸、新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、鏈霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、奈替米星等13種抗生素高度敏感，對四環(huán)素耐藥。

表4 菌株QPX1的藥敏特性

3 討論與分析

3.1 豚鼠氣單胞菌對水產養(yǎng)殖的危害性

豚鼠氣單胞菌是水產養(yǎng)殖重要病原菌，具有廣泛的致病性，已經引起南方鲇（Silurus meriordinalis）[9]、日本鰻鱺（Anguilla japonica）[10]、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）[6]、花 鱸（Lateolabrax japonicus）[11]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[12]、匙吻鱘（Polyodon spathula）[13]等多種水產養(yǎng)殖動物發(fā)病死亡，對水產養(yǎng)殖具有極強的危害性。然而，從現有文獻資料來看，關于豚鼠氣單胞菌對南美白對蝦致病的詳細報道較少，僅李梅等[5]曾報道豚鼠氣單胞菌引起廣東養(yǎng)殖南美白對蝦發(fā)生以“足須發(fā)紅、肝胰腺腫大”為典型病癥的疾病，而豚鼠氣單胞菌引起南美白對蝦黃腿病的研究尚未報道。該試驗對南美白對蝦黃腿病病原菌豚鼠氣單胞菌進行了分離鑒定，篩選了潛在防控藥物，研究結果可作為南美白對蝦黃腿病的藥物防控提供依據。

3.2 豚鼠氣單胞菌的致病機理分析

一般來說，病原菌的致病性與其毒力因子的產生密切相關。據報道[14-15]，豚鼠氣單胞菌能夠產生多種毒力因子。陽濤等[14]實驗發(fā)現，南方鲇源豚鼠氣單胞菌胞外產物具有蛋白酶、脂酶、明膠酶和脲酶活性，具有很強的溶血毒性和細胞毒性；熊靜等[15]研究表明，鰻源豚鼠氣單胞菌胞外產物具有溶血、酪蛋白酶和卵磷脂酶活性。該試驗證實豚鼠氣單胞菌對南美白對蝦具有致病性，可能與這些毒力因子的產生有關。至于豚鼠氣單胞菌引起南美白對蝦黃腿病的發(fā)病機理，目前尚未確定，可能是由于豚鼠氣單胞菌感染南美白對蝦后產生毒力因子，引起肌肉等組織出現病變和壞死，導致病蝦黃色素病理性沉積，表現出附肢變黃。當然，除了豚鼠氣單胞菌的自身因素外，該病的發(fā)生與池底腐敗有機質累積造成的病原菌滋生、養(yǎng)殖戶投喂飼料不當也有較大的關系。

3.3 豚鼠氣單胞菌的藥敏特性分析

不同來源的豚鼠氣單胞菌常常具有藥敏特性的差異性。何永龍等[12]從草魚體內分離的豚鼠氣單胞菌菌株JS對恩諾沙星、復方新諾明、氟苯尼考等抗生素高度敏感，對多粘菌素B中度敏感，對阿莫西林耐藥；韋陽道等[13]從患病匙吻鱘體內分離的豚鼠氣單胞菌菌株GXKJDX02對多粘菌素B、氟苯尼考、復方新諾明等抗生素耐藥，對恩諾沙星高度敏感。該試驗也對豚鼠氣單胞菌菌株QPX1的藥敏特性進行了分析，發(fā)現菌株QPX1對阿莫西林、多粘菌素B、復方新諾明、氟苯尼考、恩諾沙星等抗生素均高度敏感，與韋陽道等[13]分離的鱘源豚鼠氣單胞菌對多粘菌素B、氟苯尼考、復方新諾明等抗生素的敏感性有所不同，與何永龍等[12]分離的草魚源豚鼠氣單胞菌對阿莫西林的敏感性不同。此外，菌株QPX1對磺胺異噁唑、復方新諾明、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等常見水產用抗生素均高度敏感，說明菌株QPX1對常規(guī)水產用抗生素并未產生嚴重的耐藥性，為該病的合理用藥防控提供了科學依據。然而，值得指出的是，豚鼠氣單胞菌的藥敏特性會隨著時間的推移均會發(fā)生變化，因而非常有必要長期監(jiān)測豚鼠氣單胞菌對常規(guī)水產藥物的敏感性，以避免臨床盲目用藥。與此同時，養(yǎng)殖者也應該認清抗生素濫用對豚鼠氣單胞菌耐藥性產生、水產品質量安全和人類健康造成的潛在危害性，在養(yǎng)殖生產過程中要采用藥敏試驗篩選有效藥物進行抗生素的合理應用[16]，嚴格貫徹和落實農業(yè)農村部的獸用抗菌藥使用減量行動，推進南美白對蝦養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展。

4 結論

上海青浦養(yǎng)殖南美白對蝦黃腿病的病原菌是豚鼠氣單胞菌，生產上可選用新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等漁用抗生素進行防治。