新型冠狀病毒獼猴感染實驗生物安全管理

孟軻音，萬忠海，李吉平，卜昭陽，繆發明，姚騰，高玉偉，劉軍

軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122

新型冠狀病毒病（COVID-19）是繼2003年SARS、2004年禽流感、2014年埃博拉疫情以來的又一起國際公共衛生事件，目前全球感染人數不斷攀升，國際疫情仍未得到有效控制，人類生命健康受到嚴重威脅，也給社會經濟造成重大損失。故此，相關機構陸續開展了新型冠狀病毒檢測、疫苗研制、防治藥物篩選及致病機制研究工作。我國衛健委按其危害程度，將SARS-CoV-2歸為二類病原微生物進行管理，規定動物感染實驗應當在動物生物安全三級實驗室操作[1]。本文結合生物安全實驗室管理相關法律法規及實際工作經驗，以SARS-CoV-2感染獼猴為例，對風險評估、實驗室類型及關鍵防護設備、人員培訓、個體防護裝備、人員進出流程、獼猴轉運、獼猴實驗操作、消毒滅菌、意外事故處理等關鍵環節的生物安全有關事項進行闡述。

1 新型冠狀病毒感染獼猴實驗風險評估

1.1 風險評估時機及方式

在開展新冠病毒獼猴感染實驗前，應進行相關實驗活動風險評估，識別風險因素，建立風險控制措施，評估風險級別。

本實驗的風險評估由實驗人員與生物安全管理人員共同完成。實驗人員主要側重生物因子和實驗活動的風險分析，生物安全管理團隊依據生物因子特性及擬開展的實驗活動負責設施設備、個體防護裝備、人員進出、消毒滅菌、意外事故等的風險分析。

1.2 風險評估側重點

SARS-CoV-2可感染人和其他哺乳動物，除經飛沫和密切接觸傳播外，也有通過氣溶膠、糞-口及眼結膜多種途徑傳播的可能。其傳染性強、傳播速度快[2]，加之本次實驗動物為獼猴，較對鼠的生物安全管理復雜很多。因此，我們在充分考慮此病原特性及實驗動物特點的基礎上，著重在動物飼養操作籠具的設計、個體防護裝備的選用、動物逃逸風險的分析方面進行反復研討，多次論證。

2 實驗室類型及關鍵防護設備

2.1 實驗室類型

根據實驗室設施條件和動物飼養設備不同，ABSL-3分為不同類型，具備開展新冠病毒獼猴感染實驗的ABSL-3實驗室包括《實驗室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）規定的4.4.2和4.4.3類實驗室，主要區別是是否可有效利用安全隔離裝置（如生物安全柜、手套箱式隔離器）操作常規量經空氣傳播致病性生物因子。目前在生物安全實驗室使用的猴飼養隔離器主要有2類，一類是半開放式隔離器，另一類是全封閉的手套箱式隔離器。如果采用前者飼養動物，須在4.4.3類實驗室工作；如果采用后者飼養動物，則在4.4.2類實驗室即可。本實驗室采用手套箱式負壓隔離器，隔離器符合《實驗室設備生物安全性能評價技術規范》（RB/T 199-2015）的要求，因此使用4.4.2類實驗室開展獼猴感染實驗。

2.2 關鍵防護設備

開展本實驗涉及的關鍵防護設備，如生物安全柜、雙扉高壓滅菌器、過氧化氫發生器均為標準化設備，而獼猴負壓隔離裝置目前缺乏像鼠IVC籠具一樣的標準化設備。依據獼猴智力發達、攻擊性強、喜抓咬等特點，為了確保獼猴飼養和實驗操作的安全性，我們從以下幾方面考慮，設計制作了手套箱式獼猴負壓隔離器：①負壓隔離器在氣密性及相對壓差應符合《實驗室設備生物安全性能評價技術規范》（RB/T 199-2015）的要求；②負壓隔離器上應裝有傳遞窗，以便獼猴及物品的相互傳遞；③負壓隔離器上應安裝獼猴保定用人工推拉式拉桿，以盡可能避免實驗過程中獼猴對人員造成傷害；④負壓隔離器上應裝有備用風機，以避免負壓隔離器故障帶來生物安全風險；⑤負壓隔離器上應裝有鎖具。

3 培訓考核

擬進本實驗室開展工作的實驗人員，均須經過實驗室培訓并考核合格。

3.1 人員培訓

本實驗室將人員培訓分為4個等級。一級主要為生物安全通用環節培訓，包括生物安全基本知識、人員進出流程、個體防護裝備穿脫、廢棄物處理、高壓滅菌、實驗室日常清理及消毒、設施設備操作等；二級在一級培訓的基礎上增加了細胞實驗生物安全操作；三級在二級培訓內容的基礎上增加小鼠實驗生物安全操作；四級在以上三級培訓內容外，根據工作實際需要增加了大中動物（如猴、貂、狗、貓、豬等）生物安全操作。

3.2 人員考核

實驗人員經過培訓后均須接受專家組的考核，考核合格后可獲得實驗室相應等級證書，并且實驗室為每一名實驗人員單獨建立了人員技術檔案和培訓檔案。獲得一級證書的人員可作為實驗實習員進入實驗室，不得獨立開展實驗；獲得二級及以上證書的人員為實驗正式人員，可根據等級證書培訓范圍開展相應實驗。

獲得四級證書的人員方可開展SARS-CoV-2感染獼猴實驗。且由于新冠病毒是一種新的病毒，對其了解不充分，因此開展相關動物實驗可能會遇到新的問題。本實驗室在實驗開始前和實驗過程中，除了開展常規的生物安全培訓外，還多次組織實驗室管理人員和項目人員集中學習研討，及時發現并解決實驗過程中存在的問題，改進優化標準操作規程（SOP），建立了非常良好的工作交流機制，為開展新冠病毒獼猴感染實驗提供了人員技術保障。

4 個體防護裝備

4.1 個體防護裝備的選用

在ABSL-3實驗室開展實驗時，通常個體防護裝備選用雙層防護服配雙層鞋套，其中內層為棉質面料，外層為一次性防護面料，另外還須佩戴雙層手套、護目鏡和N95口罩。

在SARS-CoV-2感染獼猴實驗中，由于SARS-CoV-2傳染性極強、傳播速度極快等特點，建議面部防護選用正壓頭罩內戴N95口罩替代護目鏡。對獼猴進行麻醉、免疫、攻毒、采樣、解剖實驗時，還應根據具體情況佩戴防抓咬手套和防割傷手套，用X線對獼猴進行影像檢查時還應穿戴防輻射隔離衣。另外，用雙扉高壓滅菌器進行實驗廢棄物消毒滅菌時還應佩戴防燙傷手套。

4.2 選用時注意事項

應根據個人身材特點選擇合適尺碼的防護服，以增加實驗操作的舒適性，減少暴露風險。一次性防護服標準應符合歐標EN14126，如需無菌操作，還應符合GB 19082-2012[3-4]。

雙層手套建議選用內深外淺的乳膠或丁腈手套，以便在手套破損時容易識別。實驗過程中如外層手套被污染，應及時更換。

5 人員進出流程

5.1 一般流程

實驗室人員應遵循潔凈區、半污染區、污染區的進入原則，退出應遵循污染區、半污染區、潔凈區的退出原則。通常將更換潔凈衣物的更衣室劃為潔凈區，更換防護服的更衣室、緩沖間和緩沖走廊劃為半污染區、核心間劃為污染區[5]。

5.2 特殊流程

在SARS-CoV-2感染獼猴實驗中，實驗人員往往在動物實驗后還要進行細胞實驗，須從一個核心區轉移到另一個核心區。轉移過程中，實驗人員應在與核心間相鄰的緩沖間脫掉外層防護服，在緩沖走廊換上預先準備好的一次性防護服，既而進入下一個核心間。

6 獼猴轉運

6.1 轉運包裝物的選擇

獼猴轉運時最好選用一次性包裝物，通常采用特制的轉運籠或雙層生物安全包裝。轉運包裝物不得隨意帶出，必須經雙扉高壓滅菌器高壓后方可轉出實驗室。

6.2 轉運路線

在用獼猴開展SARS-CoV-2研究工作時，須將待養在觀察區的獼猴轉運至ABSL-3實驗室核心區負壓籠具內。根據獼猴體型特點，一般可從傳遞窗傳入。由于獼猴動作敏捷、攻擊力較強，故傳入前應先將獼猴麻醉，后經輔助區傳遞窗傳至緩沖走廊，再經緩沖走廊傳遞窗傳至核心區。

6.3 轉運方法

6.3.1 轉運人員布局 獼猴轉運時應在輔助區、緩沖走廊、核心間即潔凈區、半污染區、污染區分別布設人員，人員不可逆行，待動物轉運完畢后，潔凈區、半污染區人員方可按流程進入核心區。

6.3.2 傳遞窗的使用 用預先準備的75%酒精噴灑傳遞窗周圍，以阻斷傳遞窗內可能溢出的病毒粒子，然后打開傳遞窗，將帶有外包裝的已麻醉的獼猴放入傳遞窗后關閉傳遞窗，接著打開另外一側傳遞窗，開啟前仍須用75%酒精噴灑傳遞窗周圍，開啟后用75%酒精噴灑傳遞窗內部，待取出獼猴后關閉傳遞窗，同時開啟紫外燈照射半小時，再傳遞下一批實驗動物。

7 獼猴實驗操作

7.1 實驗內容

在動物生物安全三級實驗室進行操作的新型冠狀病毒獼猴實驗一般包括獼猴麻醉、病毒接種、采血及分離血清、體溫測量、鼻咽肛拭子采樣、病理解剖等。

7.2 注意事項

①實驗操作須2～3名人員進行；②實驗操作均須在獼猴麻醉狀態下進行；③獼猴麻醉應在負壓動物飼養箱中進行；④實驗操作過程中始終要觀察獼猴是否有蘇醒跡象，如有蘇醒跡象則對獼猴進行追加麻醉；⑤麻醉用注射器應裝入盛有消毒劑的銳器盒內消毒，而后裝入雙層生物安全包裝袋內雙扉高壓處理；⑥采血收集管應為螺口離心管，將血液從注射器推入時，管口應有酒精棉球覆蓋；⑦進行獼猴氣管內接種病毒，注射器在注入及拔出時均須通過酒精棉球；⑧注射器針頭的夾取均須用止血鉗；⑨獼猴尸體的解剖須將尸體按轉運規程運至負壓解剖箱中進行；⑩實驗用過的耗材均須放在雙層高壓滅菌袋內或放入盛有消毒液的高壓滅菌桶內浸泡后雙扉高壓處理。

8 消毒滅菌

根據國家衛健委COVID-19相關指南，酒精、含氯消毒劑、二氧化氯、過氧化氫、過氧乙酸對SARS-CoV-2有較好的殺滅作用，而氯己定對SARS-CoV-2 無效[6-7]。

綜合衛健委指南、同行推薦及本實驗室消毒劑效果驗證，從消毒劑的消毒效果、對物品的腐蝕性、對人體的危害程度等多方考量，建議正壓頭罩和主機外表面選用75%酒精噴灑消毒，外層防護服及實驗室日常消毒選用1%衛可噴灑消毒，生物安全柜日常消毒選用75%酒精噴灑擦拭消毒，需要浸泡消毒的物品采用75%酒精浸泡消毒，如有被血漬污染的的器械可先用新潔爾滅浸泡去污漬，獼猴尸體及其他廢棄物均須雙層包裝、表面消毒后雙扉高壓處理，實驗室終末消毒采用過氧化氫汽化消毒。

9 意外事故處理

實驗室意外事故有多種類型，本實驗室針對人員意外傷害、感染性物質濺灑、儀器設備故障、動物逃逸、火災及自然災害等意外事故，均制備了完善的意外事故處置預案。下面僅就與此實驗特性相關的意外事故處理加以簡單描述。

9.1 獼猴抓咬傷

獼猴天性好動、抓咬能力強，在實驗過程中一定要避免此類現象的發生。如意外發生獼猴抓咬傷，應立即停止工作，在同事配合下按程序消毒傷口退出實驗室，到醫學觀察室隔離觀察，觀察自覺癥狀，定期檢測核酸。如懷疑有感染癥狀，應立即到定點醫院就醫，如無自覺癥狀，定期核酸檢測均為陰性，2周后可解除隔離。同時，報告生物安全負責人，填寫《意外事故處理記錄》。

9.2 獼猴逃逸

因為獼猴處于清醒狀態時始終被鎖于負壓隔離器內，故發生逃逸的可能性極小。ABSL-3實驗室門處于互鎖狀態，即使獼猴發生逃逸，也不會逃出實驗室。但為了避免意外發生，實驗室內應備有專業麻醉槍，一旦發生獼猴逃逸，可利用麻醉槍對其抓捕。

面對國際頻發的公共衛生事件、日趨復雜的生物安全問題，我國大力加強高等級生物安全實驗室建設力度，有效提高了突發疫情的應對能力和處置能力，但仍須在更高層次統籌生物安全管理，總結國內外管理方法的差距，健全國家生物安全管理體系，建立國產化防護裝備和產品的各類標準。