三維肝細胞模型及其在化學性肝損傷評價中的應用

張弛 ，金虹 ，彭雙清 ，2，郭家彬 ，2

1.解放軍疾病預防控制中心，北京 100071；2.軍事科學院 軍事醫學研究院，北京 100850；3.解放軍73集團軍醫院，福建 廈門 361000

肝臟是外源性化合物代謝的主要場所，也是化學物及其代謝產物毒作用的重要靶器官。據估計，超過1100種常用化學物可誘導肝損傷，其中包括一些常用的化學藥物、中草藥和膳食補充劑等[1]。化學性肝損傷造成的肝臟疾病范圍廣，其中藥物性肝損傷是引起急性肝功能衰竭死亡的主要原因，給患者家庭以及制藥和化工等企業帶來巨大的風險和經濟損失[2-3]。傳統的肝毒性評估主要依賴于不同的動物試驗，雖然動物試驗能在一定程度上反映化學物在人體中的肝毒性，但也存在實驗周期長、費用高、通量低等諸多局限。此外，在臨床前測試中38%～51%具有肝毒性作用的化合物未能檢測出[4]。隨著“3R”原則的廣泛實施，以及人們對動物保護和動物福利的重視，越來越多的國家和地區通過立法或制定相關指導原則要求采用非動物測試。因此，研究高通量、能夠模擬人肝細胞功能的體外系統成為當前學術研究和相關商業開發的熱點問題。

近十年來，人們研究發展了多種人肝細胞來源的體外系統并應用于化學性肝損傷的風險評估。傳統的體外培養主要以二維（2D）細胞培養為主，因其簡單性和低成本等優點而被廣泛應用。但肝臟具有復雜的立體結構，2D培養方式很難重現肝臟組織的許多基本生理學功能，且很多肝細胞在體外培養系統中與人體生理狀況存在較大差異[5]。因此，應用2D培養模型開展毒性檢測的靈敏性和準確性均受到很大限制。為了使體外肝細胞模型更好地模擬人體真實情況，近年來肝細胞3D培養模型越來越受關注和青睞[6-8]。3D培養方法為肝細胞提供了一個正常表達肝臟特異性功能的微環境，能有力地彌補傳統2D細胞培養的缺陷和不足。從2D到3D，維數的增加可顯著影響細胞增殖、分化和存活率[9]。雖然目前尚不存在通用的人源肝細胞3D模型，但隨著3D技術的迅速發展，3D肝細胞模型不斷完善，并在化學性肝損傷評價中得到越來越廣泛的應用。

1 常用的人源肝細胞

常用的人源肝細胞主要包括原代培養的人正常肝細胞（PHH）、肝癌細胞、肝細胞系以及干細胞分化的肝細胞等模型。PHH是一種較為理想的體外肝細胞模型，通常可以在體外系統中維持24～72 h的肝功能活性，主要用于酶誘導和抑制研究、中等通量的化合物篩選等，被認為是體外肝細胞試驗的“金標準”。但PHH來源有限，且傳統方法難以進行長期穩定培養。多種人肝癌細胞系由于具備廉價、易于體外穩定長期培養等優勢而被廣泛使用，但大多數肝癌細胞系缺乏代謝活性，或與人正常肝細胞存在很大差異。如HepG2、LO2細胞等永生化的癌細胞系，雖可廣泛用于藥物性肝損的篩選評估，但這些細胞模型也存在酶代謝活力低等問題，如HepG2細胞缺乏大多數Ⅰ和Ⅱ相代謝酶和轉運蛋白。HepaRG細胞是一種有干性潛能的細胞株，可以分化為肝細胞樣細胞和膽管樣細胞，可高表達代謝酶活性，近年越來越多地用于肝臟疾病探究和肝毒性評估。此外，肝細胞樣細胞還可以通過人誘導的多能干細胞（hiPS-Hep）分化獲得。雖然肝細胞樣細胞的總體分化狀態已得到改善，但目前仍未獲得與成熟PHH分子表型高度相似的細胞[10]。

2 3D肝細胞模型

近年來研究開發了多種3D新型細胞模型，可通過不同培養方式維持立體形態，形成較為復雜的組織結構，建立細胞與細胞間的相互作用。這些3D細胞模型可以較好地重現肝臟的功能，并能維持藥物代謝酶和藥物轉運蛋白的表達水平，從而能更準確地對化學性肝損傷進行評估。此外，3D肝細胞可以在體外長期培養，為長期毒性探究提供了可能。下面重點介紹幾種技術相對成熟且較為常用的3D肝細胞模型。

2.1 不含支架的球狀體

無支架球體是在沒有促進細胞附著底物的情況下，通過懸浮細胞的自聚集形成的3D細胞聚集體，可利用具有超低附著（ULA）表面的多孔板、灌注攪拌槽生物反應器或懸滴培養技術等進行。HepG2是應用最廣泛的肝癌細胞系，與HepG2單層培養相比，球體培養的HepG2使MRP2和MDR1轉運蛋白的表達、白蛋白的分泌提高持續數周，并且對對乙酰氨基酚誘導的毒性敏感性增加[11]。3D HepaRG與2D培養相比，其CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4和UGT酶的活性保持穩定并顯著提高[12]，對對乙酰氨基酚和黃曲霉毒素B1等代謝致毒藥物更為敏感[13-15]。PHH是評價人類肝毒性藥物的“金標準”細胞模型。與2D培養的PHH相比，3D PHH可保持存活并具有穩定的白蛋白分泌至少5周，且蛋白質組學特征與體內的人類肝臟極為相似，在數周內仍保留其轉錄組和代謝組學譜，而來自相同供體的PHH在2D單層或三明治培養中則迅速下降。PHH球體相比于HepG2、HepaRG細胞和2D PHH可以顯著提高CYP1A2、CYP3A4等重要代謝酶的活性[16]。因此，PHH的3D培養比肝癌細胞系更具預測性。

2.2 基于支架的3D球體

在過去的十年中，使用生化和生物物理成分的組織工程支架在3D技術中取得了重大進展。目前使用較多的是源自動物組織的生物聚合物，其包含細胞在天然組織中相似的生化成分，并可能促進組織再生。最常用的天然聚合物是透明質酸、明膠、膠原蛋白、硫酸軟骨素[17]。以脫細胞的大鼠肝臟為支架的3D HepaRG球體細胞培養模型，可將Ⅰ、Ⅱ相酶，藥物轉運蛋白和核受體的表達延長至28 d，使3D模型在肝毒性測試中有更高的敏感性[18]。來自非哺乳動物的組織也被用于制造3D支架，如藻酸鹽和脫乙酰殼多糖生物聚合物等。藻酸鹽微囊化可改善HepG2和Hepa?RG球體的活力和代謝能力[19]。其他培養支架，例如半乳糖基化的纖維素海綿或聚乙二醇二丙烯酸二乙酯，可以維持人肝細胞系或干細胞衍生的肝細胞球體模型的長期肝功能[20]。

盡管研究資料表明支架材料對肝球體表型有益，但基于支架材料的肝培養物與完整肝臟之間的差異還有待進一步闡明，如這兩者之間在轉錄組、蛋白質組和代謝組水平上的差異還不清楚。此外，支架材料批次間的差異會降低細胞模型的可重復性和可比性，從而使這些模型在化學性肝損傷的評價中的應用變得復雜。基于支架的模型在應用于藥理和毒理學分析之前，還應充分考慮支架對藥物擴散的影響。

2.3 中空纖維管型生物反應器

新鮮分離或凍存的肝細胞系接種至生物反應器中，其中空纖維的外腔管狀毛細血管網滲透每個腔室，半透性中空纖維將細胞與灌注室分開，可以為肝細胞包埋提供基本的支架。肝細胞和膠原凝膠混合物可以裝載在纖維管內間隙的內部或外部[21]，培養基中的營養物質和氧氣可以通過中空纖維管膜供應給細胞，同時肝細胞產生的代謝物質和二氧化碳亦可通過跨膜交換進入培養基，提供了一種偽血管化組織模型。與用胎牛血清維持的培養相比，生物反應器中無血清的PHH培養使各種CYPⅡ相酶和藥物轉運蛋白的表達增加[22]。HepaRG生物反應器培養物中有機陰離子轉運多肽1B1（OATP1B1）的表達比PHH生物反應器中低95%，但表現出相似的CYP3A4活性[23]。由于細胞需求大，中空纖維生物反應器很少用于肝毒性評估，且昂貴，難以建立。此外，利用中空纖維生物反應器進行毒理學和藥理學研究可能由于材料會吸收疏水性藥物以及對基于成像的功能參數檢測的可行性有限而變得復雜。

2.4 3D打印細胞生物支架

現有的3D肝細胞打印技術主要采用基于噴墨的生物打印、材料擠出成型、激光輔助打印技術和光固化成型法。基于噴墨的生物打印可以使液滴中的細胞精確沉積，高通量打印出厘米大小的組織結構[24]。基于材料擠出成型的打印方式，細胞主要通過噴頭擠出絲構建成二維平面，再由二維平面組成三維實體[25]。作為惟一一種可以與無支架細胞系統兼容的培養方式，材料擠出成型的打印方式具有一定優勢，但打印速度很慢，并且打印過程中會導致相當大的剪切應力，可能對細胞造成損害。激光輔助生物打印技術主要使用激光聚焦脈沖產生的高壓液泡將含有細胞的生物材料沉積在接收基板上。由于其成本高、處理困難以及缺乏可商購的解決方案，目前應用較少。光固化成型法主要利用紫外線、紅外線等將光敏材料暴露在光源下使其固化，但打印過程中的高溫照射可能會損傷細胞。已有細胞打印技術開發了一種具有多種細胞類型的3D肝芯片，使用細胞外基質（ECM）生物墨水和血管、膽道流體通道進行3D微環境的共培養，與不具有膽道系統的芯片相比，有膽道流體通道的芯片具有肝特異性基因并表達其功能[26]。但是3D打印支架通常涉及對于細胞而言難以生存的苛刻條件，例如極壓、非生理鹽濃度和使用有機溶劑，需要克服這些條件以滿足細胞的生存。

2.5 肝臟器官芯片

為了更真實地模擬肝臟的生理功能和立體結構，肝器官芯片成為近年來3D肝細胞模型研究的熱點[27]。肝器官芯片一般包含肝細胞和成纖維細胞，它們通過圖案化方式排列[28]或以聚集形式培養[25]。有的微流體芯片將PHH和非實質肝細胞（NPC）以仿生理比例共培養在一個分層的3D組織中，該組織由類似于肝腺泡的多孔膜與肝室隔開的血管通道組成，可以模擬肝氧梯度分區，并可模擬肝竇內的部分免疫功能，包括肝竇內皮細胞（LSEC）的激活，促進多形核白細胞（PMN）的結合[29]。雖然已開發出許多肝器官芯片，但這些模型尚處于起步階段，目前還沒有關于分子表型或化學性肝損傷預測能力的全面表征數據。

3 3D肝細胞模型在化學性肝損傷評估中的應用

3.1 肝毒性篩選

臨床研究發現，許多化學性肝損傷通常在幾周甚至幾個月后出現，而且經常僅在人群中的少數幾個人中出現。由于3D模型可以在體外長期培養，因此，在化學性肝損傷中，3D細胞培養模型比2D培養的細胞可以更好地模擬延遲的肝毒性事件。高通量兼容性強的球形培養系統在此方面更有優勢。Khetani[30]等使用PHH構建3D模型，以評估35種藥物性肝損傷（DILI）陽性化合物和10種DILI陰性化合物的肝毒性，并在9 d內多次重復給藥，準確預測了其中66%藥物的毒性，特異性為90%。Bell等[31]使用PHH的肝球體和二維肝細胞培養進行5種不同肝毒素的重復劑量毒性研究，發現PHH球體在第14 d對APAP、波生坦、雙氯芬酸、氟尿嘧啶和曲格列酮高度敏感，而2D PHH培養物則較不敏感，表明3D細胞在長期重復給藥方案下的可預測性。雖然3D肝細胞模型已明顯改善了肝毒性預測，但不能解決患者特定的易感性因素，例如環境暴露或遺傳易感性。而且對于特異性藥物肝毒性，如氟氯西林、阿莫西林-克拉維酸和噻氯匹定等，由于與罕見的人類白細胞抗原（HLA）等位基因有關，由免疫系統所介導，難以進行評估[32]。

3.2 代謝產物鑒定

化學物可通過肝臟的生物轉化產生與母體分子不同的代謝產物，化學物的毒性也與新陳代謝和反應性代謝產物的形成有關，因而代謝物的鑒定和安全性評估構成了臨床前毒理學的重要方面。相比于傳統的代謝系統，例如肝微粒體、肝S9組分、肝細胞懸浮培養和肝切片等，3D PHH能維持藥物代謝酶的生理水平達數天乃至數周，并且可以高通量進行試驗，利于藥物篩選[33]。已有研究發現，3D PHH模型在孵育7 d后識別出27種（77%）藥物的人類相關代謝物，而肝細胞懸浮培養（55%）、S9（46%）和肝微粒體（39%）的檢測率低于3D PHH細胞模型[34]。不含支架的球體已鑒定出雙氯芬酸、咪達唑侖、對乙酰氨基酚和普萘洛爾的Ⅰ、Ⅱ相代謝產物，并且檢測到傳統模型未能檢測到的人體特有代謝產物[35]。利用3D模型鑒定雙氯芬酸代謝產物，發現在不同的模型中可能存在不同代謝途徑，使用中空纖維生物反應器模擬AZD6610的代謝，其在PHH生物反應器主要通過羥基化進行代謝，而在相同生物反應器中HepaRG細胞的主要代謝途徑是葡萄糖醛酸化[36]。肝臟芯片也檢測出Ⅰ、Ⅱ相雙氯芬酸代謝物，并已用于氫化可的松的代謝分析[37-38]。

3.3 毒性機制發現

化學物可通過多種機制引起肝損傷，如抑制膽汁鹽排泄、氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥以及適應性和先天性介導的免疫反應。盡管2D體外模型可以探究一種或幾種致毒途徑，但其難以模擬肝器官的復雜性[39]。研究表明，在3D PHH球體培養時可重建膽管網絡，為膽汁鹽排泄方面的毒性研究提供了可能[40]。應用“組學”技術進行全面的分子圖譜分析，可揭示導致特定藥物或候選藥物的肝毒性分子事件。已有研究表明，以多種細胞不同模型比較所選化合物的肝毒性，在3周的實驗過程發現只有肝臟球體模型表達藥物代謝酶、藥物和膽汁酸轉運蛋白、配體激活的核受體以及其他指示肝功能正常的基因[33]。在2D培養物中的研究往往局限于高暴露水平下的急性毒性事件，長期穩定的3D肝細胞培養模型為亞毒性劑量長期暴露下全面描述分子變化提供了有力工具[41]。以3D PHH作為細胞模型，評估肝毒素曲格列酮、奈法唑酮、布芬酸和托爾卡酮及其無毒結構類似物羅格列酮、丁螺酮、布洛芬和恩他卡朋暴露后的轉錄變化，發現用肝毒素處理的細胞中的轉錄變化始終高于無毒類似物，并且鑒定出肝臟有毒化合物特有的多個轉錄本，發現膽汁酸的生物合成、脂肪酸代謝和PPAR信號通路是曲格列酮調節的通路[42]。將PHH球體暴露于氯丙嗪、胺碘酮、環孢霉素A和黃曲霉毒素B1等不同致毒機制的肝毒性化合物，通過轉錄組分析發現，PHH球體模型能夠準確地重現化合物的主要毒作用機制所介導的毒效應[33-43]。這些研究表明3D肝細胞模型為闡明化學性肝損傷的作用機制提供了有力工具。

4 結語

盡管3D細胞模型在化學性肝損傷評估中具有巨大的應用價值和前景，但也面臨許多挑戰。第一，3D模型受多種因素影響和條件制約，需要對這些因素實現更加準確、穩定的控制。構建3D模型除了需要滿足傳統2D模型中的細胞模型和培養規范之外，還應注意氧氣濃度、基質材料和支架對培養體系及受試化合物生物利用度的影響。第二，雖然現有技術已可將細胞穩定維持數周，使體外肝毒性測試范圍不再局限于急性毒性，但維持長期的穩定性和功能性是一個重要問題。某些關鍵參數，如細胞活力可能在較長的培養期內保持不變，但不能排除其他參數的變化。第三，肝臟組織含多種不同類型的肝細胞，同時培養各種類型的細胞可能存在更大的可變性，因此需要更多的實驗重復和技術重復，以獲得可重復性的結果。第四，3D培養的肝細胞模型仍無法生成不同類型的血管結構和膽道細胞，但這些細胞對于人類肝臟的復雜肝臟形態和生理有很大影響。雖然多種細胞共培養可能可以改善這個問題，但同時也帶來更大的技術難點：在滿足多種細胞生長的培養基開發上存在困難，不同類型的細胞需要不同的生長條件和細胞之間的不同比例，并且不同的細胞類型需要不同的質量檢查和來源，亟待建立統一標準。第五，不同類型的3D肝細胞模型都有其自身局限性，單純的3D球體模型沒有血管結構，可能導致無法模擬人體血液與組織細胞周圍的組織液不斷交換，從而造成內部細胞和外部細胞接觸滲透率低的藥物濃度不均，并且無法提供持續的氧氣和營養物質并及時清除代謝產物廢物。中空纖維生物反應器或肝芯片又可能存在材料對藥物的吸附或吸收，產生新的技術難點。

綜上所述，3D培養的肝細胞模型雖然具有許多優勢，但仍須進一步研究并全面評估3D培養方式在肝毒性評價中的敏感性和特異性。此外，3D肝細胞模型作為一種體外替代方法，目前所開展的替代方法驗證試驗及應用十分有限，而且由于相關技術規范缺失和監管滯后等原因，其應用難以得到推廣。但隨著下一代風險評估的提出、體外毒理學的發展和化學性肝損傷評價需求的不斷增加，可以預見3D肝細胞模型將得到更多的關注和重視。