阿司匹林對丙酮醛引起的人血腦屏障內皮細胞損傷的影響

莊世芳，王艷華

西安交通大學附屬西安市第九醫院檢驗科1、病理科2，陜西 西安 710054

糖尿病是一種嚴重威脅人類健康的重要疾病，其患患者數和流行程度呈逐年增加趨勢[1]。糖尿病患者患中風、血管性癡呆、阿爾茨海默病等神經障礙的風險顯著增加，且糖尿病與這些神經系統疾病的發生都伴隨腦微血管結構和功能的異常[2-3]。丙酮醛(methylglyoxal，MGO)是糖酵解過程中的副產物，慢性高血糖引起MGO代謝增加，MGO增多是導致糖尿病患者血管內皮細胞損傷和功能喪失的關鍵始動因素[4-5]。阿司匹林是一種非甾體類抗炎藥，通過不可逆性抑制環氧酶活性發揮抗炎、止痛、抗血小板作用[6]。糖尿病患者通過每日服用低劑量阿司匹林(aspirin，ASA)來預防心血管不良事件的發生。研究表明，服用阿司匹林還能夠減少糖尿病患者發生癡呆的風險[7]，但這是否與降低MGO引起的腦微血管內皮細胞損傷有關目前并不清楚。本研究旨在探討阿司匹林對MGO引起的人血腦屏障內皮細胞損傷的影響及調控機制，為糖尿病并發癥的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細胞培養基配方均購自美國Gibco公司。阿司匹林、40%丙酮醛水溶液購自美國Sigma公司。WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光液均購自上海碧云天生物技術有限公司。LC3及GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養 人血腦屏障內皮細胞(hCMEC/D3)由法國Institut Cochin提供，培養液為RPMI 1640，添加10%胎牛血清，置于37℃、含5%CO2的細胞孵箱中培養。當細胞密度達到90%后，倒掉培養液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，0.25%胰酶消化收集細胞，制成單細胞懸液，凍存或用于實驗。

1.3 藥物干預及分組 40%丙酮醛水溶液采用去離子水稀釋，阿司匹林粉末溶于相應體積的二甲基亞砜(DMSO)，分別制成不同濃度的儲備液，并通過細胞培養液將藥物按照1:1 000的比例稀釋為工作液。所有實驗處理方法均為細胞在含不同藥物濃度的培養液中正常培養24 h，然后進行相應結果的檢測分析。首先檢測不同濃度的丙酮醛或阿司匹林對細胞活力的影響，然后將細胞進行分組處理：對照組(培養液加入對應體積的DMSO或去離子水)、MGO處理組(培養液加入1 mmol/L的MGO)、MGO聯合阿司匹林處理組(培養液加入1 mmol/L的MGO和不同濃度的阿司匹林)。每個實驗重復3次。

1.4 細胞活力檢測 將單細胞懸液加入96孔板中進行培養，5×103個/孔，待細胞密度達到50%～60%時，將細胞進行分組處理。24 h后，按照試劑盒說明書加入WST-1溶液，再繼續培養2 h，酶標儀檢測各組細胞在450 nm處的吸光度。

1.5 Caspase-3活性檢測 將細胞分組處理，然后按照試劑盒說明書操作。

1.6 活性氧水平檢測 利用熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)進行活性氧檢測。將單細胞懸液加入96孔板中進行培養，待細胞密度達到90%時，對細胞進行分組處理。實驗結束后，去除細胞培養液，加入適當體積DCFH-DA，37℃孵育20 min。然后用無血清1640培養液洗滌細胞3次，熒光顯微鏡拍照。利用Image J軟件統計每個視野中活性氧(ROS)陽性的細胞數。

1.7 蛋白質印跡法(Western blot) 收集6孔板培養的細胞，細胞組織快速裂解液(RIPA)裂解，蛋白質定量(BCA)法定量蛋白濃度，每孔上樣30μg，聚丙烯酰胺凝聚電泳并轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉條帶，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，增強化學發光法(ECL)發光顯色。

1.8 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行數據統計學分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差(x-±s)表示，多組均數間比較采用One-way ANOVA和Newman-Keuls進行顯著性檢驗，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MGO對細胞活力的影響 采用不同濃度的MGO(0.1～10 mmol/L)處理hCMEC/D3細胞24 h后，細胞活力隨著MGO濃度提高而逐步降低；當MGO濃度達到1 mmol/L時，細胞活力為(79.72±5.01)%，與0 mmol/L MGO組的(100.00±2.45)%相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 MGO對細胞活力的影響

2.2 阿司匹林對細胞活力的影響 采用不同濃度的阿司匹林(0.1～1 mmol/L)處理hCMEC/D3細胞24 h后，細胞活力隨著阿司匹林濃度提高而逐步降低；當阿司匹林濃度為0.5 mmol/L或1 mmol/L時，細胞活力為分別為(87.72±3.36)%和(81.55±2.85)%，與0 mmol/L阿司匹林組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 阿司匹林對細胞活力的影響

2.3 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞活力的影響 聯合應用1 mmol/L的MGO和不同濃度的阿司匹林(0.1～1 mmol/L)處理細胞24 h后，細胞活力隨阿司匹林濃度提高而逐步降低；當所用阿司匹林濃度為0.5 mmol/L或1 mmol/L時，細胞活力分別為(67.33±6.47)%和(59.40±5.12)%，與MGO處理組的(80.16±3.50)%比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見圖3，提示阿司匹林加重MGO引起的細胞損傷。

2.4 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞Caspase-3活性的影響 采用1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3細胞24 h后，Caspase-3活性為(112.38±4.62)%，較對照組的(100.00±2.32)%有所升高，但差異無統計學意義(P＞0.05)。MGO聯合阿司匹林處理細胞則進一步提高Caspase-3活性，當阿司匹林濃度為0.5 mmol/L，Caspase-3活性為(120.13±4.41)%，與對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；當阿司匹林濃度為1 mmol/L時，Caspase-3活性為(133.13±7.23)%，與對照組或MGO處理組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。Caspase-3是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶，提示阿司匹林可能會促進hCMEC/D3細胞凋亡。

圖3 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞活力的影響

圖4 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞Caspase-3活性的影響

2.5 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞活性氧產生的影響 采用1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3 24 h后，與對照組相比，ROS陽性的細胞數明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)；MGO聯合不同濃度的阿司匹林處理細胞后，ROS陽性的細胞數均較MGO處理組進一步增加，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

2.6 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞自噬水平的影響 采用1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3 24 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達比值較對照組上升至4.7倍(P＜0.05)，然而阿司匹林能夠完全抑制MGO引起的LC3Ⅱ表達增加，見圖6。LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化是自噬激活的標志，這提示阿司匹林抑制丙酮醛引起的細胞自噬。

圖5 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞活性氧產生的影響(20×)

圖6 丙酮醛聯合阿司匹林處理對細胞自噬水平的影響

3 討論

血腦屏障是腦組織與外界進行物質交換的窗口，能夠阻止神經毒性物質、血細胞、病原體進入腦中，其正常的結構和功能對于維持中樞神經系統穩態具有重要意義，血腦屏障破壞則與多種神經退行性疾病的發生有關[8]。糖尿病患者持續的高血糖狀態及繼發的炎癥和組織缺氧等導致體內大量蓄積丙酮醛，并促進晚期糖基化產物形成。丙酮醛與蛋白質精氨酸殘基結合，引起蛋白質結構改變、功能喪失和靶向降解，最終導致血管內皮細胞出現損傷和功能失常[4]。微血管內皮細胞是血腦屏障的主要組成部分。因此，抑制MGO引起的血腦屏障內皮細胞損傷有望減輕糖尿病相關的中樞神經系統并發癥。

臺灣地區的一項研究表明，每日服用低劑量阿司匹林能夠降低2型糖尿病患者發生阿爾茨海默病的風險[7]。其中的機制是否與減少MGO引起的血腦屏障內皮細胞損傷有關目前并不清楚。然而本研究發現，MGO及阿司匹林均濃度依賴性抑制hCMEC/D3細胞活力，MGO聯合阿司匹林處理則進一步降低細胞活力，表明阿司匹林會加重丙酮醛引起的細胞損傷。Caspase是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-3是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶，也是哺乳動物中研究最多的一個Caspase[9]。本研究發現，阿司匹林能夠進一步提高MGO引起的Caspase-3活性增加，表明阿司匹林可能會促進hCMEC/D3細胞凋亡。盡管丙酮醛在體內可通過多種途徑損害內皮細胞功能，但其危害主要跟增加ROS產生有關[10]。ROS是指包含氧原子的自由基，如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)和羥自由基(OH-)等。ROS增多對DNA、蛋白質和脂類進行氧化破壞，使細胞膜完整性受損，細胞器功能喪失，并最終導致組織細胞死亡[11]。本研究發現，與MGO處理組相比，MGO聯合阿司匹林處理能夠顯著提高細胞ROS水平，表明阿司匹林能夠促進hCMEC/D3細胞氧化應激。自噬是真核細胞內一種依賴于溶酶體的降解途徑，也是細胞重要的自我保護機制，對于清除細胞內活性氧具有重要意義[12]。相關研究證實，激活自噬能夠減輕中風發生后MGO造成的人腦微血管內皮細胞(HBMEC)損傷[13]。本研究發現，1 mmol/L的MGO處理hCMEC/D3 24 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達比值較對照組上升至4.7倍，然而阿司匹林能夠完全抑制MGO引起的LC3Ⅱ表達增加。LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化是自噬激活的標志，說明阿司匹林具有很強的自噬抑制作用。綜上所述，阿司匹林加重MGO引起的hCMEC/D3損傷，可能與其提高細胞氧化應激水平和抑制細胞自噬有關。

盡管阿司匹林能夠降低糖尿病患者發生癡呆的風險，但是這種作用似乎并不依賴于減輕MGO引起的血腦屏障內皮細胞損傷，相反它會加重MGO引起的血腦屏障內皮細胞損傷。阿司匹林更加深入詳細的藥理作用機制還有待于進一步研究。