新生鼠原代肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離、純化與鑒定

張夢穎，郭瑞敏，孫燕妮

上海中醫藥大學附屬普陀醫院中心實驗室，上海 200062

肺泡是肺部進行氣體交換的主要單位，肺泡上皮是空氣中病原體、過敏原和污染物的屏障，在生理和病理條件下對肺的重塑、修復和維持穩態起著至關重要的作用[1]。成熟的肺泡上皮由Ⅰ型肺泡上皮細胞(alveolar type Iepithelial cells，ATI)和Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar typeⅡepithelial cells，ATⅡ)組成，它們分別占肺泡表面的95%和5%[2]。ATI是鱗狀上皮細胞，覆蓋在肺泡表面，主要與鄰近的毛細血管組成氣-血屏障進行交換氣體，維持氣液界面的離子和液體平衡[3]，其中散布著立方型Ⅱ型肺泡上皮細胞[4]。ATⅡ是肺泡上皮的重要組成部分，呈立方形，細胞表面有特征性的微絨毛以及胞質內有嗜鋨性板層小體[5]。板層小體通過釋放表面活性物質相關蛋白(pulmonary surfatcant-associated protein，SP)對降低肺泡表面張力，防止肺泡塌陷，穩定肺泡形態非常重要[6]。ATⅡ又被稱為“祖細胞”，當肺泡上皮受損時，一小部分成熟的ATⅡ既可以不斷分化成為ATI，促進肺泡上皮再生及修復，保持肺部穩態，又可以更新生成新的ATⅡ[7]。同時ATⅡ還參與肺水轉運，免疫調節[8]等。因此ATⅡ不僅是肺的關鍵結構和防御細胞，也是許多肺部疾病的靶細胞，包括ARDS[9]，肺纖維化[10]，急性肺損傷等[11]，慢性阻塞性肺疾病[12]以及新生兒的肺部感染等[13]。但是，目前在一些肺部疾病的研究領域中使用的肺泡上皮細胞系，不能很好地代表肺泡上皮細胞，也不能完全模擬肺部疾病模型[14]。且Ⅱ型上皮細胞在原代培養過程中，會逐漸分化成為ATI，因此，對于要求較高的實驗采用原代分離獲取Ⅱ型肺泡上皮細胞會相更為理想。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年清潔級SD大鼠，雌、雄(180～200 g)各一只。合籠21 d分籠，可得新生鼠(普陀區中心醫院動物房提供)。

1.1.2 實驗儀器 無菌工作臺，細胞培養箱，離心機，倒置顯微鏡，透射電鏡(上海中醫藥大學提供)，共聚焦顯微鏡。

1.1.3 實驗試劑 DMEM培養基、HBSS緩沖液、胎牛血清、Anti-Anti試劑、0.25%胰蛋白酶(Gibco)，膠原酶Ⅰ(1G，Sigma)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Solarbio)，大鼠IgG(10 mg，上海翊圣生物有限公司生物)，BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒(江蘇凱基生物有限公司)，臺盼藍染色細胞存活率試劑盒、FITC標記山羊抗兔IgG、Hoechst 33342染色液(上海碧云天生物有限公司)，紅細胞裂解液(Biosharp)，4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛生物)，Anti-SPC(北京博奧森生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離 取3只出生3 d內SD大鼠，75%酒精浸泡1 min，在無菌操作臺中打開胸腔，摘取肺(盡量去除氣管、支氣管等組織)，在含Anti-Anti的HBSS溶液中沖洗，直至溶液清亮。將肺組織轉移至含DMEM培養基的100 mm2培養皿中，剪成1 mm3大小，棄培養基，加入0.25%胰蛋白酶(含EDTA，每只1.5 mL)，放入37℃，5%CO2培養箱中消化10 min。加入等量的含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基終止消化，吹打均勻后棄去液體。加入0.25%胰蛋白酶(含EDTA，每只1.5 mL)，放入37℃，5%CO2培養箱中消化15 min，加入等量的含10%FBS的DMEM培養基終止消化，吹打均勻，將液體移至50 mL離心管中。加入0.1%膠原酶Ⅰ(每只1.5 mL)，放入37℃，5%CO2培養箱中消化20 min，加入等量的含10%FBS的DMEM培養基終止消化，吹打均勻后，將液體移至50 mL離心管中。重復上述步驟3次。將收集的液體，200目濾網過濾(自然濾過，不使用外力)，收集濾液，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入5 mL含10%FBS的DMEM重懸細胞，將細胞懸液轉移至培養瓶中。

1.2.2 肺泡Ⅱ型上皮細胞的純化 將細胞懸液轉移至培養瓶中，放入37℃，5%CO2培養箱中培養40 min，將未貼壁的細胞吸出，1 000 r/min，離心5 min，重復上述步驟3次。將未貼壁細胞吸出，轉移至用大鼠IgG(1 mg/mL)包被的培養皿中，放入37℃，5%CO2培養箱中培養2 h。純化結束后，離心1 000 r/min，5 min，棄上清，加入紅細胞裂解液，體積為細胞沉淀的3～5倍，輕輕吹打，裂解1～2 min，離心(400～500)×g，5 min，棄上清。若紅細胞裂解不完全，可重復裂解。

1.2.3 肺泡Ⅱ型上皮細胞的培養 純化后，將未貼壁細胞吸出，1 000 r/min，離心5 min，用含10%FBS的DMEM重懸細胞，將分離得到的細胞濃度調整為(1～3)×106/mL接種于6孔板，放入37℃，5%CO2培養箱中培養24 h后換液。

1.3 肺泡Ⅱ型上皮細胞的鑒定

1.3.1 透射電鏡鑒定 細胞貼壁后，會用0.25%胰酶消化細胞，含10%FBS的DMEM終止消化，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加0.5 mL 5%戊二醛固定。制備為電鏡細胞標本，于透射電鏡下觀察肺泡Ⅱ上皮細胞胞質內的特征性板層小體(嗜鋨小體)。

1.3.2 免疫熒光鑒定(共聚焦顯微鏡) 細胞貼壁后，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次。加入PBS稀釋的SP-C一抗(1∶500)，4℃孵育24 h，PBS洗3次。加入FITC標記的羊抗兔IgG(1：500)37℃孵育2 h，PBS洗3次。加入Hoechst 33342染色液1 mL，室溫避光孵育20 min，PBS洗2～3次，每次3～5 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.3 BCIP/NBT堿性磷酸酶試劑盒鑒定 細胞貼壁后，棄培養基，PBS洗1～2次，4%的多聚甲醛(覆蓋細胞即可)固定細胞20 min，PBS洗3～5次，每次5 min，按照說明書配置BCIP/NBT工作液，室溫避光5～30 min或更長(24 h)，去除BCIP/NBT工作液，蒸餾水洗1～2次，終止顯色反應。室溫避光晾干，于顯微鏡下觀察。并計算細胞純度。

1.4 細胞活力測定 純化完成后，取少量細胞懸液1 000 r/min，離心1 min，棄上清，500μL細胞重懸液重懸細胞，吸取100μL重懸的細胞到離心管內，加入100μL臺盼藍染色液，輕輕混勻，染色3～5 min。染色完成后，吸取少量染色后的細胞，用血細胞計數板計數，至少數500個細胞，計算細胞活力。細胞活力=(細胞總數－藍色細胞數)/細胞總數×100%。

1.5 統計學方法 采用SPSS24.0統計學分析軟件，計量資料以均數±標準差(s)描述。

2 結果

2.1 原代Ⅱ型肺泡上皮細胞 細胞培養24 h后，鏡下觀察原代Ⅱ型肺泡上皮細胞呈單層平鋪在培養皿中，立方形，呈島狀生長，胞漿內可見黑色顆粒，見圖1。

圖1 細胞培養24 h

2.2 透射電鏡鑒定 電鏡下可觀察到細胞呈不規則圓形，胞質內有細胞器，并有黑色板層小體，細胞膜上有微絨毛，見圖2。

圖2 細胞電鏡

2.3 免疫熒光鑒定 共聚焦顯微鏡下可觀察到胞質內呈綠色熒光的SP-C表達，以及呈藍色熒光的細胞核，見圖3。

圖3 共聚焦顯微鏡

2.4 BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒鑒定 顯微鏡下可看到細胞胞漿內含藍紫色顆粒，見圖4。細胞純度≥92%。

圖4 BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒鑒定

2.5 細胞活力鑒定 原代ATⅡ培養24 h活力為(94.82±1.64)%，胞純度為(95.96±0.90)%。

3 討論

原代肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離提取，實驗動物的選擇多種多樣，有選擇用成年SD大鼠[15]或小鼠[16]，麻醉后氣管插管，灌注消化液消化一定時間后，整體取出心肺，將肺組織剪碎繼續消化分離細胞。此方法所使用的成年鼠成本較高，利用率低，且易污染。或選擇胎鼠，整體取出肺，進行消化分離細胞。此方法需對雌鼠進行剖腹，再對胎鼠進行剖胸，過程繁瑣，且因雌鼠個體差異，剖腹獲得的胎鼠不一定滿足實驗需要。本實驗采用出生3 d內的新生鼠，將雌鼠、雄鼠按照2∶1合籠，21 d左右分籠，即可獲得大批的新生鼠，實驗成本較低且容易獲得。

肺泡Ⅱ型上皮細胞的消化分離，主要選用胰蛋白酶，膠原酶和彈性蛋白酶。彈性蛋白酶消化作用好，性質溫和，分離出細胞純度在90%以上[15]，但價格昂貴且不易獲得。胰蛋白酶可以使細胞間的蛋白質水解，破壞細胞間的連接從而使細胞離散。常用工作濃度為0.25%，在pH為8.0，溫度為37℃時，胰蛋白酶的作用最強。采用0.25%(含EDTA)的胰蛋白酶，消化時間為15 min，避免了因消化過度而造成細胞損傷，且其中所含的EDTA能夠螯合Ca2+和Mg2+，從而破壞細胞連接促進細胞解離，與胰蛋白酶聯用，消化效果更好。膠原酶主要水解組織中的膠原成分，僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大，其中膠原酶Ⅰ主要用于上皮、肺、脂肪和腎上腺組織的細胞分離，與0.25%胰蛋白酶交替使用，消化效果較好。

張秋月等[17]采用0.25%胰蛋白酶消化后，經200目濾網過濾。離心再加入0.1%膠原酶消化，再經離心純化。實驗過程中我們發現胰蛋白酶消化過程結束后，產生的膠原成分使殘余肺組織及消化下來的細胞黏連在一起，不能很好的通過200目濾網，過濾困難，因此在終止消化后選用3 mL無菌吸管輕輕吹打，將肺組織吹至離散狀態后能明顯看到消化液變渾濁，再收集上清。加入適量膠原酶Ⅰ繼續消化，再收集上清。并增加了兩次胰蛋白酶-膠原酶的交替消化過程。將三次消化后所收集的上清經200目濾網統一過濾。

酶消化后的細胞懸液中除了AT-Ⅱ外，還有成纖維細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等。為了獲取高純度的Ⅱ型上皮細胞一般采用密度梯度離心法、差速貼壁法、免疫黏附、流式分選等。因成纖維細胞較上皮細胞貼壁時間短，故先采用差速貼壁法來去除成纖維細胞。大鼠IgG免疫黏附法是近年來最常采用的純化方法，新生鼠肺消化得到的細胞懸液中肺泡巨噬細胞、中性粒細胞等表面有Fc受體，可以與IgG結合，貼壁在大鼠IgG包被過的培養皿上。而AT-Ⅱ表面沒有Fc受體，不會與IgG結合，所以經大鼠IgG免疫黏附純化后的未貼壁細胞即為AT-Ⅱ[18]。摘取肺組織過程中，不能全部去除紅細胞，因此在細胞純化結束后加入了紅細胞裂解液裂解紅細胞。若是不進行純化后計數等實驗操作，因紅細胞不貼壁，可通過換液去除紅細胞。

原代AT-Ⅱ的鑒定方法有很多種，電鏡是鑒定AT-Ⅱ的金標準，電鏡能夠非常直觀的看到AT-Ⅱ胞漿內有板層小體，各種細胞器以及細胞表面的微絨毛，但價格昂貴。肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌的表面活性物質(pulmonary surfatcant-associated protein，SP)有四種相關蛋白包括SP-A，SP-B，SP-C和SP-D，尤其是SP-C僅在肺泡Ⅱ型上皮細胞表達，采用免疫熒光法，共聚焦顯微鏡下可觀察到綠色熒光表達的SP-C，因此也可作為鑒定肺泡Ⅱ型上皮細胞的依據[19]。AKP是AT-Ⅱ分劃標記物，可適用于區別巨噬細胞。曾慶富[20]采用BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒鑒定ATⅡ，細胞內AKP反應物呈深藍色。該方法簡便有效且十分經濟。本實驗中分別采取電鏡、共聚焦顯微鏡以及BCIP/NBT堿性磷酸試劑盒對提取的原代AT-Ⅱ進行鑒定，鑒定結果理想。

除離心操作外，整個過程均在無菌工作臺中進行，嚴格執行無菌操作。所用手術器械經高溫滅菌，消化液及清洗組織的HBSS都含有抗生素，從未出現細胞污染。此次從降低細胞污染概率、消化時長及次數、純化過程以及細胞過濾方面等進行了改進。整個過程耗時6 h左右，并獲得了較高純度且產量不低的AT-Ⅱ，可滿足體外實驗的需求。此次實驗仍有許多不足，原代細胞的分離方法雖簡單但是耗時過長，仍需要不斷地改進與優化。