基于“調氣血，和陰陽”探析逆針灸對高血壓家族史大學生非杓型血壓晝夜節律的影響※

王艷君 石 芳 蘭向東 龐國明 何 立 何紅濤 計彥新 張文明 安向平

(河北中醫學院附屬醫院針灸科，河北 石家莊 050011)

晝夜節律是一種接近24 h(19～28 h)的生物周期[1]，能夠使機體功能適應日常環境變化。人體的心血管、內分泌等系統均存在晝夜節律變化，若晝夜節律紊亂則會導致這些系統功能障礙，增加罹患心腦血管疾病、肥胖、糖尿病等慢性疾病的風險[2-3]。以血壓晝夜節律為例，人體血壓24 h的波動節律即為血壓晝夜節律，呈現“雙峰一谷”的“長柄杓”形曲線，具有益于適應機體活動、保護靶器官等功能，而紊亂的血壓晝夜節律是獨立于血壓水平的重要致病因素，對靶器官損害更為嚴重[4]。因此尋求調節血壓晝夜節律方法尤為重要。研究表明，針刺能夠治療非杓型高血壓，可以起到降壓和調節律的雙重效應[5]。目前針刺的降壓療效確切，但其調節血壓晝夜節律的作用機制尚不明確。同時有研究表明,新陳代謝和晝夜節律緊密相關，晝夜節律在調節能量穩態方面起關鍵作用，而脂質則是涉及系統能量代謝和體內平衡的主要介質[6]。故本研究基于“調氣血，和陰陽”探析逆針灸對大學生非杓型血壓晝夜節律的調節作用，探究針刺是否可以逆轉紊亂的晝夜節律及可能機制，旨在為今后臨床針刺調節血壓節律提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本課題組前期以216名血壓正常的健康大學生作為觀察對象，進行24 h動態血壓監測和體質問卷調查，結果顯示47名大學生有高血壓家族史，其中30例學生的血壓晝夜節律為非杓型，17例為杓型，表明高血壓家族史與血壓晝夜節律之間存在相關性，具有高血壓家族史的健康大學生血壓晝夜節律為非杓型的可能性較大。本研究選取前期研究中具有高血壓家族史的非杓型健康大學生30例作為研究對象，其中男7例，女23例;年齡20～28歲,平均(23.6±1.4)歲；體質量47.5～76 kg,平均(57.89±7.84)kg;身高155～184 cm,平均(165.34±12.17)cm。研究流程中針刺治療、數據采集和數據分析分別由專人負責。

1.2 納入、排除、中止試驗及脫落標準

1.2.1 納入標準 ①在校學生，18歲≤年齡≤30歲；②有高血壓家族史；③血壓在正常范圍內；④血壓晝夜節律為非杓型；⑤患者自愿接受本治療，簽署知情同意書；⑥本研究方案獲得河北中醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準，批準編號為20150918-1。

1.2.2 排除標準 ①原發性高血壓或繼發性高血壓患者；②合并有心、腦、肝、腎和造血系統等嚴重原發疾病，精神病患者,呼吸睡眠暫停綜合征；③正在參加其他可能影響本研究結果評價的受試者。

1.2.3 中止試驗及脫落標準 ①患者依存性較低，未按療程進行治療，或研究期間自行退出者；②服用影響血壓及其節律的藥物，而干擾結果者；③受試者出現嚴重并發癥或危急情況，不適宜繼續治療者。

1.3 治療方法 全部受試者均予針刺治療。取穴：曲池(雙)、足三里(雙)。定位：曲池，在肘橫紋外側端，屈肘時，當尺澤與肱骨外上髁連線的中點處；足三里，在小腿前外側，當犢鼻穴下3寸，距脛骨前嵴外一橫指(中指)，平脛骨粗隆下緣處。操作方法：患者取仰臥位，醫生以押手輕觸、揉按針刺局部皮膚，揣摩深淺，確定針刺的腧穴，針刺部位皮膚常規以碘伏消毒后，選用0.30 mm×40 mm華佗牌一次性無菌針灸針，以左手輕觸固定所針刺的腧穴，右手持針快速刺入皮下。直刺1寸，每穴行小幅度的提插捻轉，行平補平瀉手法，使局部有熱脹感，留針20 min，期間每10 min行針1次，共行針2次。受試者于每日上午7:00～9:00接受治療，每周連續治療5 d，休息2 d，共治療2周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 記錄動態血壓 ①統一采用ri-cardio型24 h動態血壓監測儀(德國里斯特公司)進行24 h動態血壓監測，白天(6：00～21：59)每間隔30 min測量血壓1次，夜間(22：00～次日5：59)每間隔1 h測量血壓1次。記錄期間患者日常活動不受限制，囑患者在監測儀自動測血壓時右臂保持靜止，監測期間避免劇烈運動。血壓監測包括24 h平均收縮壓、24 h平均舒張壓、白天平均收縮壓、白天平均舒張壓、夜間平均收縮壓、夜間平均舒張壓。治療前1周內和治療后1周內受試者分別測量1次。②血壓晝夜節律：根據動態血壓監測結果，計算夜間平均血壓下降率=(日間血壓均值-夜間血壓均值)/日間血壓均值×100%。夜間平均血壓下降率10%～20%為杓型，<10%為非杓型，<0為反杓型，>20%為超杓型。當夜間平均血壓下降率在收縮壓與舒張壓上表現不一致時，以收縮壓為準。

1.4.2 血漿脂質提取 所有受試者在治療前后均抽取空腹肘靜脈血4 mL，采集后血液在室溫下凝結30 min，后以3 000 r/min離心15 min。后取血清上清液并保存在-80 ℃環境中備用。將100 μL血漿與900 μL異丙醇混合，渦旋10 s以上，超聲10 min，混合物在-20 ℃下冷凍1 h，然后以10 000 r/min離心10 min。收集上層800 μL液體并轉移至樣品瓶中，以進行注射，并通過高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)法進行分析。

1.4.3 UPLC-Q-TOF/MS分析 質量控制(QC)樣品通過匯集所有血清樣品的等分試樣來制備，所述血清樣品代表待分析的血清樣品。采集期間，每5個樣品注射1次空白樣品(異丙醇∶水=90∶10)和質控樣品。使用ACQUITY UPLC一級UPLC系統(英國曼徹斯特沃特世公司)與Xevo G2-S Q-TOF電噴霧電離四重飛行時間質譜儀(英國曼徹斯特沃特世公司)耦合，進行UPLC-Q-TOF/MS分析。沃特世ACQUITY UPLC CSH色譜柱[粒度，1.7 μm；50 mm(長)×2.1 mm(內徑)]用于液相色譜分離，柱溫保持在55 ℃。流速為0.4 mL/min，進樣量為2 μL。流動相A為0.1%的脂肪酸和10 mm的甲酸銨(在丙烯腈∶水中為60%∶40%)，流動相B為0.1%的脂肪酸和10 mm的甲酸銨(在異丙醇∶丙烯腈中為90%∶10%)。線性梯度設置如下:40% B,0～2 min 40% B to 43% B,2～2.1 min 43% B to 50% B,2.1～12 min 50% B to 54% B,12～12.1 min 54% B to 70% B,12.1～18 min 70% B to 99% B,18～18.1 min 99% B to 40% B,18.1～20 min 40% B。

高精度的質譜數據由MassLynx 4.1軟件記錄(英國曼徹斯特沃特世公司)。采用Waters-QTOF質譜儀(英國曼徹斯特沃特世公司)獨立于數據的MSE掃描方法，可自動獲得所有前體離子的高精度一次質譜和二次質譜數據。正負模式的毛細管電壓均為3.0 kV，錐形電壓均為25 V。源溫度設定為120 ℃，錐型氣體流量為50 L/h，去溶劑化溫度設定為450 ℃，去溶劑化氣體流量為850 L/h。亮氨酸-腦啡肽(英國曼徹斯特沃特世公司)被用作鎖定物質，在正模式下以m/z 556.2771產生參考離子，在負模式下以m/z 554.2615產生參考離子，該離子是由鎖頻儀(英國曼徹斯特沃特世公司)以5 μL/min引入的，用于數據校準。均方誤差數據是在2個掃描函數中使用斜坡碰撞能量以連續模式獲得的。對于低能量模式，掃描范圍為50～2 000 Da，掃描時間為0.2 s，碰撞能量為6 V。對于高能量模式，掃描范圍為50～2 000 Da，掃描時間為0.2 s，碰撞能量為15～60 V。

1.5 數據處理和統計分析 質譜原始數據經過處理，峰注釋和標準化，以及通過數據庫搜索進行的脂質鑒定，均由Progenesis QI軟件(英國曼徹斯特沃特世公司)完成。分析不同組之間的所有脂質種類，對于每個單獨的樣品，所有檢測到的脂質種類的強度按脂質類別進行匯總。每個脂質類別的相對量以百分比計算。配對樣本中各脂質種類的強度采用非參數Wilcoxon符號秩檢驗(R package) 進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。使用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)完成多變量統計分析，并獲得在特征變量投影重要性(VIP)>1的脂質。

2 結 果

2.1 30名受試者針刺前后血壓節律改變情況 針刺治療后，30名受試者中有7名受試者血壓晝夜節律由非杓型轉為杓型，23名受試者血壓節律未改變。見表1。

表1 30名受試者針刺前后血壓節律改變情況

2.2 30名受試者針刺前后夜間血壓下降率比較 見表2。

表2 夜間血壓下降的變化

由表2可見，7名針刺后血壓節律轉為杓型的受試者與23名治療后血壓節律未變的受試者相比，其夜間收縮壓和舒張壓均明顯下降，但處于正常范圍內。

2.3 受試者針刺治療前后總色譜圖比較 針刺治療前后血清樣品的UPLC-Q-TOF/MS圖以陽性和陰性模式顯示在圖1中。治療前后總體色譜圖無明顯差異。見圖1。

注：針刺治療前后血清樣本的代表性UPLC-Q-TOF/MS圖。A:積極模式；B:消極模式。上:針刺治療前；下:針刺治療后。

2.4 經過數據過濾后，在最終數據分析中選擇了429個變量(脂質峰)(323個峰在ESI+模式，106個峰在ESI-模式)，對每個脂質類和亞類的所有檢測到的脂質種類的強度進行了匯總。針刺后由非杓型血壓轉為杓型血壓者，其血清中谷氨酸氨基轉移酶低于非杓型血壓者，而血清甾醇高于非杓型血壓者。對亞類的進一步分析表明，杓型血壓磷脂酰膽堿明顯較低。見圖2。

圖2 脂質種類的強度匯總

2.5 鑒別杓型血壓與非杓型血壓的關鍵脂質的發現與鑒定 見圖3，表3。

注：A：OPLS-DA評分圖，藍色的點是以B為代表的針刺前的樣本；紅點是以A為代表的針刺后的樣本。B：OPLS-DA評分S圖，紅色框內的點是VIP>1的變量。

表3 7名從非杓型血壓轉為杓型血壓受試者針刺前后血清中VIP>1的脂質

由圖3A可知，OPLS-DA評分圖顯示了7名受試者在針刺治療后由非杓型血壓轉變為杓型血壓，模型具有良好的擬合和預測性能(R2Y=0.99，Q2Y=0.88)。由圖3B和表3可知VIP值大于1的變量(脂質種類)被認為在群體分離中起重要作用，共篩選出29種VIP>1的脂質，具有區分杓型血壓和非杓型血壓的作用。

2.6 受試者針刺前后OPLS-DA評分圖比較 見圖4。

由圖4A可知，當使用OPLS-DA觀察23名受試者在針刺治療前后的組間差異時，這些受試者并未從非杓型血壓轉變為杓型血壓，OPLS-DA評分圖僅顯示了血脂譜的差異趨勢，但不能很好地區分2組(R2Y=0.57，Q2Y=0.37)。由圖4B可知，對針刺后血壓水平和晝夜節律變為杓型的7名受試者進行了相同的分析作為對照。結果顯示配對血清與正常對照組沒有分離趨勢(R2Y=0.35，Q2Y=0)。

在以上2組中也計算了VIP值。為了減少間接影響血脂譜但與血壓夜間下降無關的其他因素的影響，從表2中篩選出圖4的OPLS-DA中VIP>1的血脂。嚴格過濾后，只有4種脂質，即磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)、甘油三酯(18∶1/19∶0/22∶6)、3’-磺基半乳糖凝集素(d18∶1/18∶0)和甘油二酯(16∶0/20∶3)(表3以粗體顯示)，在區分杓型和非杓型血壓方面具有特異性。

注：A：23名受試者針刺前后OPLS-DA評分圖；B：7名受試者針刺前后OPLS-DA評分圖

2.7 針刺前后非杓型轉為杓型7名受試者脂類物質濃度的統計分析 見圖5。

由圖5可知，用Wilcoxon秩檢驗法篩選出6種脂類物質PC(20∶4/17∶0)、PC(22∶0/20∶4)、PS(O-18∶2/17∶0)、PS(O-20∶2/17∶0)、DG(16∶0/18∶3)、TG(20∶4/18∶220∶4)，在針刺前后比較差異有統計學意義(P<0.05)。在與VIP篩選的4種脂質結合后，只有PC(20∶4/17∶0)被鑒定為能夠指示和辨別血壓晝夜節律狀態的關鍵脂質種類。

圖5 針刺前后7名受試者脂類物質濃度的統計

3 討 論

晝夜節律廣泛存在于人類和其他哺乳動物中，參與調節多種生理、心理和行為變化，是生命活動的本質特性[1]。晝夜節律的中樞位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)，且廣泛表達于心臟、腎臟、骨骼肌等組織中[7-8]。晝夜節律紊亂會導致睡眠、心血管、代謝等多種功能障礙的發生[2-3]。人體正常血壓節律為“兩峰一谷”長柄杓狀樣特征波動模式，夜間收縮壓較晝間收縮壓下降比率為10%～20%，此種血壓波動模式對保證機體各種生理活動及維護心、腦、腎等重要臟器功能十分重要[9]。研究表明，血壓晝夜節律異常者伴發心臟、腎臟、血管靶器官損害以及心血管病的風險明顯增加[10-12]。而臨床研究表明，針刺能顯著降低血壓，改善晝夜血壓節律[13]。閻琦等[14]研究發現針刺人迎穴為主不僅能使血壓下降，而且可將非杓型恢復為杓型，并且針刺時間越長，杓型曲線越明顯。白樺等[15]證實，百會透刺前頂能夠在顯著降低晝夜平均收縮壓和平均舒張壓的基礎上，對晝夜血壓節律和降低腎素水平產生一定作用。既往研究發現，高血壓具有家族聚集性，是高血壓患病的獨立危險因素[16]。有高血壓家族史的患者患高血壓的風險是無家族史的2～4倍[17]。同時研究表明，高血壓家族史是非杓型血壓晝夜節律紊亂的危險因素。本研究以具有高血壓家族史的非杓型健康大學生為觀察對象，采用“逆針灸”調整陰陽，糾正紊亂的血壓晝夜節律。

中醫學認為，血壓作為人體氣血陰陽運行的外在表現之一，其晝夜節律受氣血陰陽盛衰規律的影響呈現“雙峰一谷”的節律變化?！吨胁亟洝吩唬骸瓣柺加谧忧?，末于午后，陰始于午后，末于子前，陰陽盛衰，各有時，更始更末，無有休止?！闭f明人必須適應自然界的周期性變化，反之則會導致陰陽失調，影響正常的血壓晝夜節律[18]。《素問·調經論》言“血氣不和，百病乃變化而生”?？梢姎庋蓙y導致臟腑功能失調，引發多種節律紊亂性疾病。故血壓晝夜節律紊亂的主要病機是陰陽失調，氣血失和。因此，本研究在“調氣血，和陰陽”理論的指導下，以“逆針灸”調整人體氣血，平衡機體陰陽，實現以平為期的目標。其選穴組方取陽明經穴曲池、足三里進行針刺。陽明經為多氣多血之脈，陽明之脈乃二陽合明，主司聚合，有內斂陽氣、納陰蓄血之效。曲池可攝納陽明氣血，使氣血下降，平亢盛之肝陽，鎮上逆之邪火，有平衡陰陽之功。足三里是胃經合穴，胃之下合穴，有和胃健脾、升降氣機、通腑化痰之功用，重在調臟腑氣血之平衡。并根據人體晝夜氣血流注變化規律和血壓“雙峰一谷”晝夜節律，于血壓晨峰(即辰時，7：00～9：00)為治療點，選二穴合用，擇時針刺，調和氣血，改善血壓晝夜節律，發揮將非杓型血壓晝夜節律轉變為杓型的效應。

本研究結果顯示，針刺治療后，30名受試者中7名變為杓型晝夜節律。脂質分析顯示，磷脂酰膽堿、甘油三酯、3’-磺基半乳糖凝集素和甘油二酯在針刺治療前后變化有差異，其中磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)可能是可以區分非杓型血壓與杓型血壓受試者的關鍵脂質物種。表明針刺調節血壓晝夜節律可能與調節磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)、甘油三酯(18∶1/19∶0/22∶6)、3’-磺基半乳糖凝集素(d18∶1/18∶0)和甘油二酯(16∶0/20∶3)的代謝相關，磷脂酰膽堿(20∶4/17∶0)可能是鑒別杓型和非杓型血壓晝夜節律的關鍵物質。

綜上所述，針刺能夠逆轉具有高血壓家族史非杓型血壓節律大學生的血壓節律，其作用機制可能與調節脂質代謝相關。由于研究樣本量較小，治療周期較短，使得非杓型血壓晝夜節律轉變為杓型血壓晝夜節律的例數較少。今后應當增加樣本量，延長干預時間，進一步實現全身性脂質譜的綜合表征，探索潛在的生物標志物用于區分杓型和非杓型型血壓，為針刺調節血壓晝夜節律提供思路，也為針刺治療其他節律紊亂性疾病提供參考依據。