肺心寧湯對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠基質金屬蛋白酶9及基質金屬蛋白酶抑制劑1水平的影響※

馬志娟 舒 亮 楊 爽 黃 燕

(內蒙古自治區中醫醫院肺病科，內蒙古 呼和浩特 010020)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全氣流受限為特征，以慢性咳嗽、咯痰、呼吸困難為主要臨床表現的呼吸系統常見病，氣道重塑是COPD氣流受限的根本原因[1]。目前，雖然COPD氣道重塑的確切發病機制尚未明了，但已有研究表明其發生發展與炎癥反應、細胞外基質合成與降解失衡、氧化應激、細胞凋亡密切相關，其中細胞外基質合成與降解失衡是導致COPD氣道重塑的重要環節之一[2]。肺心寧湯具有清熱化痰、寬中散結的功效，是我們臨床治療肺系疾病的經驗方[3]，先前研究表明其對于COPD模型大鼠具有良好的治療效果，可以減輕大鼠氣道炎癥，改善血管內皮功能[4]，但肺心寧湯是否對COPD氣道重塑也有改善作用尚未得到證實。我們擬通過觀察肺心寧湯對COPD模型大鼠基質金屬蛋白酶9(MMP-9)及基質金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)水平變化影響，探討肺心寧湯對COPD氣道重塑的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級Wistar雄性大鼠60只，體質量150～160 g，飼養于內蒙古自治區中醫醫院動物實驗中心，室溫20～23 ℃，濕度50%～60%，由內蒙古大學實驗動物中心提供，許可證號：SAXK(蒙)2016-0001。

1.2 實驗藥品及物品 肺心寧湯(藥物組成：黃連3 g，杏仁6 g，瓜蔞15 g，澤瀉6 g，半夏 9 g，茯苓9 g，枳實6 g，陳皮6 g，炙甘草3 g，由內蒙古自治區中醫醫院制劑室負責制成湯劑，生藥含量0.525 g/mL)；醋酸潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33021207)；脂多糖(美國SIGMA公司)；紅梅牌香煙[紅塔煙草(集團)有限責任公司，烤煙型]；自制有機玻璃染毒箱(長×寬×高：100 cm×50 cm×50 cm，在箱體兩側均有直徑約1.5 cm的換氣孔)。

1.3 主要試劑及儀器 MMP-9酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測試劑盒及TIMP-1 ELISA檢測試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)；通用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-Time PCR)試劑盒(M-MLV)及內參抗體(β-actin)(美國Promega公司)；Trizol總RNA抽提試劑(美國Invitrogen公司)；Real-Time PCR儀(瑞士Roche公司)；UItra SYBR Mixture(美國Invitrogen公司)；CT15RE臺式高速冷凍離心機(日本日立公司)；JT-12電腦生物組織脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；RM 2016輪轉式切片機(德國Leica公司)；BX53生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及模型制備 將60只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、醋酸潑尼松組、肺心寧湯低劑量組、肺心寧湯中劑量組及肺心寧湯高劑量組，每組10只。除正常組外，其余5組均參照文獻[5]中COPD的造模方法，采用煙熏加氣道內滴入脂多糖制作COPD模型，造模周期為90 d。

1.4.2 COPD模型評價 造模結束后，各組均隨機抽取2只大鼠處死，取大鼠肺組織進行蘇木精-伊紅(HE)染色做成病理切片后在生物顯微鏡下觀察，可見肺泡壁變薄、斷裂，肺泡腔擴大，部分融合成肺大泡，肺間隔增厚，大量炎性細胞浸潤，說明COPD大鼠模型制作成功。見封3，圖1。

1.4.3 給藥方法 正常組及模型組按6.3 mL/kg予蒸餾水灌胃，醋酸潑尼松組按0.027 g/kg予醋酸潑尼松片藥液灌胃，肺心寧湯低、中、高劑量組分別按3.3、6.6、13.2 mL/kg予肺心寧湯藥液灌胃，每日1次，連續灌胃28 d。

1.4.4 取材 各組大鼠末次灌胃24 h后腹腔麻醉并處死。剖開腹部，通過腹主動脈采血適量，靜置30 min，以3 000 r/min離心5 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待測。打開大鼠胸腔，剝離肺組織，用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈后將肺組織剪為2部分，一部分放入凍存管，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 肺組織病理形態學變化 將采用多聚甲醛溶液固定的肺組織用梯度酒精脫水、浸蠟、包埋，制成石蠟塊，切片，采用HE染色法進行染色，最后在生物顯微鏡下觀察肺組織病理形態學變化。

1.5.2 血清MMP-9及TIMP-1檢測 將冷凍保存的血清標本常溫解凍后置于超凈工作臺上，均采用ELISA法對血清MMP-9及TIMP-1水平進行檢測，相關操作按試劑盒說明書進行。

1.5.3 肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA檢測 采用Real-Time PCR法檢測肺組織中MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表達情況。首先取凍存的肺組織，放入研缽中加入液氮進行研磨，磨成粉末狀后，采用Trizol試劑盒從肺組織中提取總RNA。然后所得總RNA樣本根據45 ℃，55 min，95 ℃，5 min條件，在Real-Time PCR儀中進行逆轉錄反應以得到對應的cDNA。最后在Real-Time PCR儀上按照如下反應程序進行擴增反應：預變性，95 ℃，10 min；變性，95 ℃，15 s；退火/延伸，60 ℃，1 min，40個循環。以β-actin作為內參照。采用2-△△CT法分析樣品間的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠灌胃后肺組織形態結構及病理變化 正常組大鼠肺泡壁結構完整，肺泡腔無擴大，肺泡腔內無明顯滲出，肺間隔未見增厚，無明顯炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺泡腔擴大，肺泡壁變薄、斷裂，部分融合成肺大泡，肺間隔增厚，大量炎性細胞浸潤。醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組在灌胃干預治療后，大鼠肺組織出現不同程度的肺泡腔擴大，炎性細胞浸潤，但較模型組病理程度減輕，其中肺心寧湯高劑量組肺泡擴張較少，肺泡結構大致正常，少量炎性細胞浸潤，其余3組治療效果均差于肺心寧湯高劑量組。見封3，圖2。

2.2 各組大鼠灌胃后血清MMP-9及TIMP-1水平比較 見表2。

表2 各組大鼠灌胃后血清MMP-9及TIMP-1水平比較

由表2可見，與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-9水平明顯升高(P<0.05)，TIMP-1水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組血清MMP-9水平均明顯降低(P<0.05)，TIMP-1水平均明顯升高(P<0.05)。肺心寧湯各劑量組組間比較，肺心寧湯中、高劑量組血清MMP-9水平均明顯低于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，TIMP-1水平均明顯高于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，且肺心寧湯高劑量組血清MMP-9及TIMP-1水平改善均優于肺心寧湯中劑量組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠灌胃后肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA相對表達情況比較 見表3。

表3 各組大鼠灌胃后肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA相對表達情況比較

由表3可見，與正常組比較，模型組大鼠肺組織MMP-9 mRNA表達明顯升高(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組肺組織MMP-9 mRNA表達均明顯降低(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表達均明顯升高(P<0.05)。肺心寧湯各劑量組組間比較，肺心寧湯中、高劑量組肺組織MMP-9 mRNA表達均明顯低于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表達均明顯高于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，且肺心寧湯高劑量組肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表達改善均優于肺心寧湯中劑量組(P<0.05)。

3 討 論

氣道重塑是以氣道慢性炎癥為發生基礎，是氣道炎癥慢性化發展的必然結果，包括基底膜的假性增厚、細胞外基質的改變、平滑肌增生肥大等，研究表明COPD患者支氣管壁較正常人明顯增厚，并發生有氣道組織的結構變化[6-7]。COPD患者發生氣道重塑與細胞外基質的合成與降解失衡關系密切，正常情況下細胞外基質的合成與降解維持在一個動態平衡狀態，對保護組織損傷起著關鍵性的作用，一旦平衡失調，細胞外基質過度的合成或降解，都會影響到氣體交換，進而影響氣道結構，加重氣道纖維化，最終導致氣道阻塞，引起氣流受限[8-9]。因此，維持細胞外基質合成與降解平衡對延緩COPD病情的發生、發展具有重要意義。MMP-9及TIMP-1是干預細胞外基質合成與降解的關鍵因子，其水平變化常常作為反映COPD氣道重塑過程中炎癥程度與氣道修復的關鍵指標[10-12]。MMP-9是一種蛋白水解酶，作為一種降解酶其不僅可以降解氣道及肺組織細胞外基質成分，使肺泡腔擴大，肺泡彈性回縮能力減弱，從而導致氣流滯留，還可介導炎癥細胞聚集，破壞上皮和內皮結構，加重炎性反應，且其活性程度與COPD呼吸受限程度呈正比[13-14]。TIMP-1是MMP-9特異性的抑制酶，其可與MMP-9催化位點結合形成聚合物，通過降低MMP-9的活性來抑制細胞外基質的降解，減少降解產物在黏膜下層聚集，此外TIMP-1還具有促進成纖維細胞增殖和膠原合成的生長因子樣作用，促進組織修復[15-16]。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠灌胃后血清MMP-9水平及肺組織MMP-9 mRNA表達均明顯升高(P<0.05)，血清TIMP-1水平及肺組織TIMP-1 mRNA表達均明顯降低(P<0.05)。說明造模后模型組發生氣道重塑。

COPD屬中醫學喘證、咳嗽、肺脹等范疇。《靈樞·五閱五使》言：“肺病者，喘息鼻張。”《靈樞·脹論》言：“肺脹者，虛滿而喘咳。”《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治》言：“咳而上氣，此為肺脹，其人喘，目如脫狀。”中醫學認為，COPD發病主要與肺、脾二臟相關，脾為生痰之源，肺為貯痰之器，外邪犯肺，肺氣失宣，又脾氣不足，運化失司，聚濕為痰，郁久化熱，痰液熏蒸，痰火交阻于肺，肺失宣降，上逆為喘。《太平圣惠方》中記載：“邪氣與正氣相搏，不得宣通，胸中痞塞，痰飲留滯，喘息短氣，晝夜常嗽，不得睡臥也。”我們所用肺心寧湯是由經典名方小陷胸湯化裁而來，方中瓜蔞清熱化痰，寬胸散結，以通胸膈之痹；黃連配伍半夏，寒熱并用，辛開苦降，泄熱除痞，化痰散結；陳皮、枳實燥濕化痰，行氣健脾；茯苓淡滲利濕；杏仁宣肺平喘；澤瀉健脾寧心，利水滲濕；甘草調和諸藥。諸藥合用，使痰熱得以消散，肺氣得以宣降，具有健脾燥濕、清熱化痰、宣肺理氣、寬中散結的功效。現代藥理學研究表明，小陷胸湯合抵當湯可能通過降低肺纖維化大鼠細胞外基質含量而發揮治療肺纖維化作用[17]；瓜蔞中的氨基酸能減少炎性分泌物的分泌，從而發揮抗炎的作用[18]；半夏中提取的總生物堿可延長咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數，起到鎮咳祛痰的作用[19]；陳皮中揮發油可擴張支氣管，改善氣流受限[20]。本研究結果顯示，經過相應灌胃干預治療后，與模型組比較，醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組血清MMP-9水平及肺組織MMP-9 mRNA表達均明顯降低(P<0.05)，血清TIMP-1水平及肺組織TIMP-1 mRNA表達均明顯升高(P<0.05)，且肺心寧湯高劑量組改善效果均優于肺心寧湯中、低劑量組(P<0.05)，說明肺心寧湯的治療效果與醋酸潑尼松一致，并存在一定的量效關系。

綜述所述，肺心寧湯對于COPD大鼠具有確切的治療作用，其作用機制可能為降低血清MMP-9水平，升高TIMP-1水平，抑制肺組織MMP-9 mRNA表達，促進TIMP-1 mRNA表達，進而干預氣道重塑過程，改善肺組織病理損傷，延緩病情進展，且其對COPD的改善作用與劑量呈正相關。