葛根素聯合有氧運動對非酒精性脂肪肝大鼠SIRT1介導肝細胞自噬的保護作用研究※

金秋芳 梁國強 葛惠男 包曉敏 孫 柳 惲海峰

(南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院保健科，江蘇 蘇州 215009)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，病變主體在肝小葉，以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜臺征，常伴有肥胖或超質量，很容易發展為肝硬化，繼而轉為肝細胞癌的風險增加[1]。當前研究表明，NAFLD負向轉歸進展過程中，大量肝細胞線粒體存在受損情況，而細胞內存在的自噬機制能夠清除受損的亞細胞器，維持肝細胞內的穩態，是細胞存活的關鍵[2]，自噬可降解肝細胞內脂滴，減輕炎性反應，改善肝細胞脂肪變性[3]。依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NAD+)的沉默信息調節因子1(SIRT1)可調節多種與線粒體增殖和自噬相關的轉錄因子的表達及活性，對維持肝細胞內穩態平衡具有極其緊密的關聯性[4]。臨床實踐及既往研究發現，單純控制飲食、適度的有規律有氧運動可延緩NAFLD的病理進展，并最終改善患者生存質量，對于改善肝臟脂質代謝紊亂、外周胰島素抵抗(IR)和機體的抗氧化能力降低等均有一定作用，但仍存在患心血管疾病和癌癥的風險[5-6]。

中醫防治NAFLD越來越顯示出獨特優勢，與現代的運動醫學、預防醫學和康復醫學等既有交叉又有特色。未病先防、既病防變和瘥后防復為中醫倡導“治未病”的主要思想，通過飲食起居、情志調理、運動療法及中醫藥等多種措施調節人體的陰陽氣血平衡，增強抗病能力[7]。葛根素是中藥葛根的主要活性成分，藥理研究表明其有改善心血管功能、保護血管內皮細胞、降低血糖和改善IR的作用[8]。目前多數研究僅對飲食運動或藥物單方面干預NAFLD的作用機制進行研究，缺乏運動聯合中藥主要成分對SIRT1介導肝細胞自噬的保護作用研究。因此，我們通過動物實驗研究葛根素聯合有氧運動對NAFLD大鼠肝細胞自噬相關蛋白調控的影響，同時觀察SIRT1介導細胞自噬的交互機制，探討其治療作用和可能機制，為中藥活性成分聯合運動防治NAFLD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠53只，體質量180～220 g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動物許可證號：SCXK(蘇)2017-0043。自由攝食、飲水，室溫24±2 ℃，明暗各半。

1.1.2 實驗藥物 葛根素(阿拉丁控股集團有限公司)；羥甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)測定試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)；蘇木素、伊紅(廣州鴻泉生物科技有限公司)；戊二醛固定液、鋨酸固定液、醋酸鈾染色液、檸檬酸鉛染色液(阿拉丁控股集團有限公司)；Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ抗體[艾博抗(上海)貿易有限公司]；p62(美國Cell Signaling Technology公司)；SIRT1抗體(美國GeneTex公司)；廣譜二抗(上海長島生物技術有限公司)；多聚甲醛(上海醫藥集團股份有限公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 實驗儀器 大鼠有氧運動游泳箱(吳門醫派研究院中心實驗室自制，1.5 m×1.0 m×0.5 m)；全自動生化分析儀(美國杜邦公司)；酶標儀(Infinite F50型，瑞士Tecan公司)；石蠟切片機、攤片機(湖北徠克醫療儀器有限公司)；超薄切片機(LKB-V型，瑞典LKB公司)；透射電鏡(H-600型，日本日立公司)；數碼相機(D5100型，日本NIKON公司)；正置顯微鏡(CX41型，OLYMPUS公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF，邁博瑞生物膜技術有限公司)；TBST(Tris-HCl，NaCl，tween20)緩沖液[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；超敏化學發光(ECL)液(美國默克公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將53只SD大鼠適應性飼養1周后，按照隨機數字表法分為空白組10只，造模組43只。

1.2.2 造模 造模組43只大鼠予高脂飼料(普通飼料+豬油100 g/kg+膽固醇20 g/kg)，自由飲水；空白組10只大鼠予普通飼料飲食。均喂養10周。最后1次喂養結束后，從造模組大鼠中隨機選取3只大鼠，處死驗證造模成功[9]。隨后將造模組剩余40只大鼠按照隨機數字表法分為模型組、葛根素組、運動組及葛根素+運動組，各10只。

1.2.3 給藥方法 葛根素組、葛根素+運動組大鼠予葛根素250 mg/kg(葛根素以0.5%羥甲基纖維素鈉溶解為25 mg/mL混懸液)，灌胃容積為10 mL/kg，每日上午灌胃給藥，現用現配；空白組、模型組、運動組大鼠予等容積的雙蒸水灌胃，每日1次。均灌胃4周。運動組、葛根素+運動組大鼠于第1、2、3 d在水溫28～32 ℃有氧運動游泳箱內分別適應性游泳30、60、90 min，以后運動方案固定，參照文獻[10]，每日固定時間(上午9：00左右開始)游泳90 min，每周運動5 d，持續4周。空白組、模型組、葛根素組大鼠關在籠中不運動。

1.2.4 標本制作 末次灌胃干預后，禁食不禁水18 h，以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血，分離血清并用凍存管分裝，置于-80 ℃冰箱中保存；采血后解剖摘取肝臟。剪取肝組織約0.5 cm3若干塊，置于10%多聚甲醛液固定，用于制作病檢標本。另摘取小塊肝組織，戊二醛固定液固定(4 ℃保存)，待透射電鏡下觀察線粒體及自噬體超微結構。余下肝組織，-80 ℃保存，待蛋白質印跡(Western Blot)法測定相關蛋白。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 血清學相關指標檢測 在全自動生化分析儀上采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶偶聯(GPO-PAP)比色法檢測血清TG、TC，雙試劑直接法檢測HDL-C、LDL-C；采用紫外比色法檢測血清ALT、AST，酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測IL-1β、TNF-α水平。

1.3.2 肝組織正置顯微鏡、電鏡病理形態學觀察 取各組經10%多聚甲醛液固定的肝組織，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法，進行脫水透明、浸蠟包埋、切片、脫蠟、染色、封固后，正置顯微鏡下觀察肝組織形態及脂滴分布狀況,并采用數碼相機拍照。另取戊二醛固定液固定的肝組織，依次行鋨酸固定、脫水包埋、使用超薄切片機切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，根據要求進行透射電鏡觀察拍照分析。

1.3.3 肝組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、SIRT1蛋白檢測 采用蛋白質印跡(Western Blot)法檢測肝組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、SIRT1蛋白表達，取肝組織裂解、勻漿后留取上清，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，分離并轉移到PVDF膜上，室溫孵育1 h，封閉過的膜對應抗體，4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜。與ECL試劑作用，X線攝片記錄實驗結果。以GADPH為內參照，采用imag J圖像處理軟件測定蛋白。

2 結 果

2.1 各組大鼠治療前后體質量比較 見表1。

表1 各組大鼠治療前后體質量比較

由表1可見，治療前后模型組、葛根素組、運動組、葛根素+運動組大鼠體質量均高于空白組(P<0.05)。治療后葛根素組、運動組、葛根素+運動組大鼠體質量均低于模型組(P<0.05)；葛根素+運動組大鼠體質量均低于葛根素組、運動組(P<0.05)；治療后葛根素與運動組大鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較 見表2。

由表2可見，模型組TC、LDL-C均高于空白組(P<0.05)，HDL-C低于空白組(P<0.05)；葛根素組、運動組、葛根素+運動組TG、TC、LDL-C均低于模型組(P<0.05)，HDL-C雖高于模型組但比較差異無統計學意義(P>0.05)。運動組TC高于葛根素組(P<0.05)，葛根素+運動組TC、LDL-C均低于葛根素組(P<0.05)。葛根素+運動組TC、LDL-C均低于運動組(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較

2.3 各組大鼠治療后血清AST、ALT及IL-1β、TNF-α水平比較 見表3。

表3 各組大鼠治療后血清AST、ALT及IL-1β、TNF-α水平比較

由表3可見，與空白組比較，模型組AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，干預各組AST、ALT、IL-1β水平均明顯下降(P<0.05)，葛根素+運動組TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；與葛根素組比較，運動組AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均上升但比較差異無統計學意義(P>0.05)；葛根素+運動組AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均低于葛根素組、運動組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠肝組織病理形態學觀察

2.4.1 鏡下(HE染色)結果 空白組肝組織肝小葉結構良好，肝板排列整齊，未見炎性細胞浸潤和脂肪變，細胞核圓形均質紅染；模型組肝小葉結構破壞，肝板排列紊亂，可見肝細胞肥大呈氣球樣變和脂肪空泡性變，可見炎性細胞浸潤，并且部分肝細胞核則被脂滴擠得明顯偏位；與模型組比較，干預各組大鼠肝組織病理形態學改變均有不同程度的改善，以葛根素+運動組改善最為明顯，肝小葉結構和肝板大多排列趨向良好和整齊，炎性細胞浸潤和脂肪滴明顯減少。見封2，圖1。

2.4.2 透射電鏡結果 空白組的肝細胞整體清晰，線粒體結構正常，嵴機構和內外膜完整，各細胞器排列分布均正常，內質網、核糖體、粗面內質網、溶酶體、細胞器豐富，自噬結構體偶見。模型組電鏡下可見脂滴彌漫性分布，肝細胞可見大小不一的空泡細胞和內質網腫脹，核糖體脫落，線粒體數量增加且形態異常變扁圓，各細胞器存在缺失情況，多成無序排列，可見少量自噬體結構。與模型組比較，干預各組的肝細胞內部脂質體相對減少，線粒體空泡化、不規則性的異常變化均有不同程度的改善，且細胞輪廓趨向正常，以運動+葛根素組自噬溶酶體及被包裹的內容物明顯增多。見封2，圖2。

2.5 各組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p62、SIRT1蛋白表達比較 見表4。

表4 各組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1、p62、SIRT1蛋白表達比較

由表4可見，模型組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p62、SIRT1表達均高于空白組(P<0.05)。葛根素組、運動組、葛根素+運動組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均低于模型組(P<0.05)，葛根素組、葛根素+運動組大鼠肝組織Beclin-1均高于模型組(P<0.05)，葛根素組、葛根素+運動組大鼠肝組織p62均低于模型組(P<0.05)，葛根素組、運動組、葛根素+運動組大鼠肝組織SIRT1均高于模型組(P<0.05)。與葛根素組比較，葛根素+運動組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，運動組Beclin-1降低，p62運動組升高，葛根素+運動組降低(P均<0.05)。與運動組比較，葛根素+運動組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1均升高，p62降低(P均<0.05)。

3 討 論

現代社會人們飲食結構多樣，NAFLD、2型糖尿病和代謝綜合征等與IR相關的代謝性疾病逐年增加。隨著全民健康意識的不斷提高，合理膳食、運動已廣泛應用于多種疾病的防治中[11]。有文獻分析及前期研究表明，現代運動醫學、預防醫學和營養學等防治NAFLD發揮了重要作用[12]，與傳統中醫學“未病先防、既病防變”理念不謀而合。單純的中藥活性成分治療可明確降低血脂，改善肝損傷，配合規律性的有氧運動后，可改善肝細胞功能，在降低血脂、改善IR情況下，改善脂肪在肝臟內沉積[13]。本實驗采用高脂膳食誘導的NAFLD模型大鼠進行4周干預研究，結果顯示葛根素聯合有氧運動可明顯降低NAFLD模型大鼠體質量及血脂、肝功能、炎癥因子指標，病理組織學改變也得到明顯改善，與既往關于葛根素或有氧運動干預脂肪肝的研究結果一致[14]。

現代醫學研究證實，NAFLD的主要誘因之一是肝細胞線粒體功能障礙，主要體現為肝細胞線粒體中超微結構損傷及自噬體階段性浮動變化等[15]。本實驗的肝細胞線粒體及自噬體超微結構觀察結果顯示，NAFLD大鼠肝組織電鏡下可見肝細胞脂滴彌漫性分布，大小不一的空泡性細胞，內質網腫脹、核糖體脫落和線粒體數量增加及形態扁圓等細胞器缺失的情況，又可見少量自噬體結構[16]。葛根素聯合有氧運動干預下可明顯改善線粒體損傷，同時觀察到自噬溶酶體及被包裹的內容物明顯增多。進一步的Western Blot法檢測結果顯示，與模型組比較，葛根素+運動組肝細胞自噬標志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表達下調，Beclin-1表達上調，p62和Beclin-1理論上雖然優于單一干預的葛根素組和運動組，但LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于單一干預的葛根素組和運動組，提示葛根素聯合有氧運動對NAFLD大鼠肝細胞自噬保護作用尚需進一步研究[17]。

SIRT1作為組織細胞中沉默信息調節因子2家族成員之一，主要是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，是其自我保護的一種重要分子，在機體細胞周期、細胞衰老、凋亡和新陳代謝等方面的調節中發揮重要作用，在NAFLD肝組織內通過蛋白質和組蛋白的去乙酰化導致基因轉錄和蛋白質功能的上調或下調，能提高線粒體的生物源和功能，也能導致各種代謝途徑的改變[18]。本實驗Western Blot法檢測結果顯示，模型組肝組織中SIRT1表達與空白組比較差異無統計學意義，葛根素組、運動組、葛根素+運動組SIRT1表達均明顯上調。既往研究SIRT1去乙酰化活性的調控作用已被證明對NAFLD的病理生理機制存在一定關聯性，尤其對細胞自噬、凋亡均具有積極作用[19]。因此提示，葛根素聯合有氧運動協同調節SIRT1-肝細胞自噬通路，改善NAFLD轉歸，機制可能為作用肝細胞SIRT1信號通路，提高SIRT1的表達和活性。推斷其通過去乙酰化作用而抑制核轉錄因子κB(NF-κB)p62蛋白積聚或激活自噬小體的形成等，調控自噬的相關蛋白表達，進入程序性死亡，而防止非程序性死亡。

隨著對NAFLD研究的不斷深入和人們健康意識的不斷提高，結合體育運動和傳統中醫治未病“先安未受邪之地”的思想，加強相應的干預研究是必然趨勢。有規律、合適的運動配合藥食同源的植物活性成分可協同降低NAFLD風險。因此，研究葛根素聯合有氧運動協同緩解NAFLD“二次打擊”的惡性循環的進程，調控SIRT1介導細胞自噬的抗NAFLD分子機制，探討抗NAFLD過程中可能的靶點、途徑及調控機制，為有效的中藥活性成分聯合有氧運動防治NAFLD提供更多的實驗依據具有積極意義。