不同產地卷柏屬藥用植物的HPLC指紋圖譜研究

李煥婷，安 明，賈克文，張 茹，高博聞

(包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040)

1 前言

在我國出產的卷柏屬植物約為70多種，其中有20多種具有藥用價值[1]，廣泛分布于我國東北、華北、華東、中南及陜西、四川等地。墊狀卷柏又名九死還魂草，為中國藥典2015年版所收載品種，其化學成分結構復雜，生物活性強，具有活血通經之功效[2]。

近幾年，越來越多的學者對卷柏中化學成分進行分析，因此，在卷柏中通過提取分離并鑒定出一系列新的、復雜的化合物。其中，黃酮類、酚炔類等化合物都具有較好的藥理活性。卷柏分布極其廣泛，具有良好的藥用價值，但是對于不同產地卷柏化學成分的研究比較少。本次實驗以我國不同地區的卷柏為研究對象，利用HPLC法分析不同地區卷柏化學成分的差異；通過指紋圖譜處理軟件分析不同種卷柏的共有峰、相似度，為其臨床用藥、質量控制提供依據。

2 實驗儀器與材料

2.1 實驗儀器

實驗中主要儀器見表1。

表1 實驗儀器

2.2 實驗材料與試劑

實驗中所用到的五種產地卷柏及所用試劑見表2和表3。

表2 卷柏藥材來源

表3 實驗試劑

3 實驗方法

3.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate LP-C18(4.6mm×250mm,5.0μm)，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脫(見表4)，流速1.0mL/min，檢測波長330nm，柱溫為30℃，進樣量為20μL。

表4 流動相梯度洗脫條件

3.2 供試品溶液的制備

稱取卷柏粉末約2g，置于小燒杯中，精密加入80%(體積分數下同)甲醇20mL，保鮮膜密封，用電子天平稱其質量，在50℃下超聲提取40min，放冷，然后再一次稱其質量，用80%甲醇補足差量，搖勻，過濾，再經0.45μm的微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液進樣。

3.3 方法學考察

3.3.1精密度實驗

精密量取供試品溶液S3，按照3.1中所列的色譜條件24小時內連續進樣六次。

3.3.2重復性實驗

精密量取供試品溶液S3六份，按照3.1中所列的色譜條件24小時內連續進樣六次。

3.3.3穩定性實驗

精密量取供試品溶液S3，按照2.1中所列的色譜條件24小時內每隔4小時檢測一次。

4 結果與討論

4.1 卷柏樣品HPLC指紋圖譜與相似度評價

按照3.1中所列的色譜條件，測出5個樣品的高效液相色譜圖，將5個色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版。經系統處理，得到5種產地供試品的相似度(見表5)、共有峰(見圖1)，最終確立了6個峰為5個樣品的共有峰，同時得到這6個共有峰在5個供試品HPLC色譜圖中的保留時間、峰面積(見表6)。共有峰的選取原則為5批樣品都含有的峰，且出峰時間合適并與其臨近的峰分離良好[3]。

表5 HPLC圖譜相似度評估結果

表6 共有峰的峰面積與保留時間

4.2 方法學考察結果

4.2.1精密度實驗

實驗表明，主要共有峰相對保留時間RSD均小于2.67%，相對峰面積RSD均小于4.31%，表明該方法精密度良好。

4.2.2重復性實驗

實驗表明，主要共有峰的相對保留時間RSD小于1.78%，相對峰面積RSD小于2.56%，表明該方法重復性良好。

4.2.3穩定性實驗

實驗顯示，共有峰的相對保留時間均小于2.93%，相對峰面積的RSD值小于1.24%，表明樣品溶液在一定時間內穩定性好。

4.3 討論

4.3.1檢測波長的選擇

于全波長檢測器下對供試品溶液進行分析，在波長330nm處色譜峰最多、紫外吸收良好，最終確定在330nm波長下對供試品溶液進行檢測。

4.3.2流動相的選擇

通過選用不同流動相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸)、不同洗脫條件進行實驗，結果甲醇-0.1%磷酸水在相應梯度條件下得到的色譜峰分離效果最好。

5 結論

在指紋圖譜處理軟件中，以湖北卷柏HPLC圖譜為參照，以中位數法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.20，進行色譜峰自動匹配，生成了5種產地卷柏的指紋圖譜，并得到6個分離度較好的共有峰；各共有峰的相對保留時間一致，相對峰面積則存在較大差異，說明不同來源的卷柏生長表型不同，但含有一定的共有成分，只是含量有所差異；5種產地卷柏相似度高達0.901～0.983，說明各地卷柏所含化學成分極其相似。該實驗方法簡單易行，可作為卷柏質量控制及指紋圖譜建立的方法。