肺炎支原體檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

賀凌煜，朱文勇，楊麗源，廖國(guó)陽(yáng)

1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650599；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染是社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneu?monia，CAP）最常見的病因之一，它與很多呼吸道感染性疾病有關(guān)，如支氣管炎、肺炎，還可誘發(fā)哮喘等疾病[1]。肺炎支原體肺炎（MP pneumonia，MPP）通常被稱為“行走性肺炎”，預(yù)后良好[2]。在肺炎支原體大流行期間，兒童和老人是易感人群，成人MPP 的發(fā)生率為社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎的4%～8%，在流行期分別增加了20%和70%[3-5]。盡管在感染預(yù)防和抗菌藥物方面取得了重大進(jìn)展，肺炎仍然導(dǎo)致顯著的死亡率，世界衛(wèi)生組織估計(jì)，下呼吸道感染是世界上最常見的死亡傳染病原因，每年有近350 萬(wàn)人死亡。MP 感染的總體死亡率較低，但文獻(xiàn)報(bào)道由MPP 導(dǎo)致進(jìn)入ICU 病房的患者死亡率高達(dá)30%，尤其是老年人[6]。MP感染的患病率被廣泛低估，因?yàn)榇蠖鄶?shù)感染MP的患者很少有癥狀而尋求醫(yī)療，并且由于其假定的良性性質(zhì)，缺乏具有良好敏感性和特異性的診斷測(cè)試，因此在很大程度上仍然未被診斷[7-9]。由于缺乏用于檢測(cè)這種非典型呼吸道病原體的標(biāo)準(zhǔn)化、敏感和特異性的方法[10]，大多數(shù)采用經(jīng)驗(yàn)診斷及治療[11]。然而，目前肺炎支原體出現(xiàn)了大面積耐藥現(xiàn)象[12]，因此，選擇一種快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法特別重要[13]。

1 肺炎支原體檢測(cè)方法

肺炎支原體目前的檢測(cè)常用方法有物理學(xué)檢測(cè)、培養(yǎng)法檢測(cè)、抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等。

1.1 物理學(xué)檢測(cè)

支原體肺炎的癥狀和診斷是多方面的，會(huì)伴隨著發(fā)熱、心動(dòng)過(guò)緩[14]?；颊叩穆犜\可以顯示出晚期吸氣性噼啪聲或正常肺泡聲，然而，由于毛細(xì)支氣管炎，有時(shí)可以聽到雙側(cè)和弦喘息[15]。放射學(xué)檢查結(jié)果被歸類為鞏固組（腦葉或節(jié)段性鞏固）和非鞏固組（斑片狀浸潤(rùn)，局部網(wǎng)狀結(jié)節(jié)浸潤(rùn)或肺門旁支氣管浸潤(rùn)）。Cho 等[15]認(rèn)為在年齡較大的兒童中經(jīng)常觀察到鞏固性病變，并且與更嚴(yán)重的臨床特征相關(guān)。Tomoo 等[16]發(fā)現(xiàn)在成人病例中很少觀察到胸腔積液，與免疫功能低下的患者相比，免疫功能正常的患者傾向于顯示更廣泛的陰影，由于血清學(xué)診斷方法無(wú)法提供100%可靠的診斷，因此物理和放射檢查的整合對(duì)于準(zhǔn)確診斷支原體肺炎至關(guān)重要。

1.2 培養(yǎng)法檢測(cè)

培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)室是指將病人的咽試紙或痰樣在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分別經(jīng)過(guò)0.45 與0.22 μm的濾膜，最后如果得到澄清透亮的菌體則為肺炎支原體，但周期較長(zhǎng)，一般最少需要1 周時(shí)間[17]。醫(yī)院一般會(huì)取樣涂皿，顯微鏡下觀察是否會(huì)出現(xiàn)油煎蛋狀的菌體，周期至少為1 周[18]。肺炎支原體感染的黃金診斷標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是轉(zhuǎn)換或升高的IgG 滴度，但抗體結(jié)果對(duì)兒童的年齡和免疫狀態(tài)敏感，特別是難以獲得恢復(fù)期血清[19]。有研究表明，口咽部若存在耐藥菌或多重耐藥菌以及對(duì)某些抗生素有天然耐藥機(jī)制的細(xì)菌時(shí)，會(huì)造成肺炎支原體快速培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[20]。

1.3 抗原檢測(cè)

肺炎支原體抗原檢測(cè)方法目前有ELISA 定量、免疫層析法、抗體-捕獲酶-免疫測(cè)定法（Ag-EIA）、量子點(diǎn)標(biāo)記抗體檢測(cè)抗原。Miyashita 等[21]研究發(fā)現(xiàn)一種商業(yè)快速抗原試劑盒（日本東京旭化成制藥公司）的診斷靈敏度僅為實(shí)時(shí)PCR 的60%。之后，Li 等[22]采用膠體金免疫層析法，以p1基因?yàn)榘悬c(diǎn)快速診斷肺炎支原體，并與實(shí)時(shí)PCR做比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)PCR 中的雙標(biāo)本陽(yáng)性為陰性，膠體金分析的特異性和靈敏度分別為100%和97.4%，從而證明新開發(fā)的免疫層析抗原檢測(cè)方法是鑒定肺炎支原體的一種快速、靈敏、特異的方法，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，可用于肺炎支原體感染的早期診斷。Onari 等[23]使用PA 抗體和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）作為金標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)免疫層析法測(cè)試的靈敏度更高。Namkoong 等[24]使用照相顯影增加免疫色譜測(cè)定靈敏度的新型銀擴(kuò)增免疫層析（SAI）系統(tǒng)，評(píng)估了快速肺炎支原體診斷系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)它能夠以較低的抗原濃度檢測(cè)所有測(cè)試樣品，并且與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)。與實(shí)時(shí)PCR 相比，該系統(tǒng)具有90.4%的靈敏度和100.0%的特異性；與LAMP 方法相比，該結(jié)果還證明了該系統(tǒng)的高性能，靈敏度為93.0%，特異性為100.0%。SAI 系統(tǒng)使用專用設(shè)備進(jìn)行自動(dòng)分析和讀取，使其具有高度客觀性，并且只需較少的人力，從而支持其在臨床環(huán)境中的實(shí)用性?？乖东@雖然不如PCR 敏感，但它的優(yōu)勢(shì)在于，不需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室操作即可避免假陽(yáng)性結(jié)果[25]。量子點(diǎn)標(biāo)記抗體檢測(cè)抗原的方法操作簡(jiǎn)單、快速，適用于早期的肺炎支原體診斷[26]。ELISA 抗原檢測(cè)具有快速簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)[27]，但是本科室使用購(gòu)買的產(chǎn)品交叉反應(yīng)問(wèn)題很突出。

1.4 血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，速度較快，成本較低，是常規(guī)臨床實(shí)踐中肺炎支原體診斷的基本策略，已經(jīng)通過(guò)靈敏分析檢測(cè)不同抗體類別的廣泛可用性得到了改善[28]。但血清學(xué)檢測(cè)在感染早期的檢測(cè)上存在很大的問(wèn)題，如靈敏度特別低。目前有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、酶免疫試驗(yàn)（EIA）、明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）、間接免疫熒光抗體法（IFA）、電化學(xué)發(fā)光方法（CLIA）等。其中，PA 操作簡(jiǎn)單，但不能準(zhǔn)確鑒別出IgM 抗體；IFA 易受實(shí)驗(yàn)人員的影響；相比之下CLIA 則比較穩(wěn)定[29]。Chen 等[30]比較了 IFA 和 PPA 檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)當(dāng) MP抗體滴度為±1∶40 時(shí)應(yīng)解釋為陰性，PPA 顯示出高特異性。Petitjean 等[31]證實(shí)，IgM EIA 血清學(xué)檢測(cè)是兒童肺炎支原體感染早期診斷的有效工具，只要使用的EIA 檢測(cè)是特異性的。在成人中，對(duì)EIA 測(cè)試的困難解釋表明，準(zhǔn)確診斷應(yīng)該要求配對(duì)血清，結(jié)合對(duì)患者入院時(shí)收集的呼吸道標(biāo)本的PCR 檢測(cè)。檢測(cè)肺炎支原體感染的黃金診斷標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是血清轉(zhuǎn)換或IgG 滴度升高，但抗體結(jié)果對(duì)兒童的年齡和免疫狀態(tài)敏感，特別是在兒科醫(yī)院難以獲得恢復(fù)期血清[32]。由于IgM 早于IgG出現(xiàn)，因此血清中IgM 的檢測(cè)是早期血清學(xué)診斷肺炎支原體感染的一種廣泛使用的方法，特別是在兒童中[33]。血清學(xué)檢測(cè)的靈敏度取決于是否在疾病發(fā)作后早期或晚期收集第一份血清樣本以及配對(duì)血清的可用性，因?yàn)檫M(jìn)行準(zhǔn)確診斷需要配對(duì)的血清樣本，在疾病發(fā)作后3～4 周出現(xiàn)滴度上升[34]。即使在恢復(fù)后，血清檢測(cè)也會(huì)持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間陽(yáng)性結(jié)果。因此，通常難以僅基于急性期[35]單個(gè)血清樣品的抗體滴度進(jìn)行診斷[36]。Beersma 等[37]用實(shí)時(shí)PCR 肺炎支原體DNA 檢測(cè)作為金標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估12 種市售血清學(xué)測(cè)定（用于IgG 和IgM）和補(bǔ)體結(jié)合測(cè)試（CFT），很少有商業(yè)血清學(xué)檢測(cè)用于檢測(cè)肺炎支原體感染，在敏感性和特異性方面具有適當(dāng)?shù)男阅?，并且PCR 在確定的患者組中對(duì)于診斷肺炎支原體感染變得越來(lái)越重要。由于肺炎支原體是季節(jié)性流行病，并且晚期診斷增加了周圍環(huán)境感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要一種快速且實(shí)用的改進(jìn)診斷系統(tǒng)[38]。

1.5 分子生物學(xué)檢測(cè)

PCR 是目前直接病原體檢測(cè)的首選方法，但一些PCR 相關(guān)方法提供了增強(qiáng)的靈敏度或更方便的處理程序，并已成功用于研究，這些技術(shù)包括實(shí)時(shí)PCR、巢式PCR、咽拭子樣本的RT-PCR、多重PCR[39]。由于其比培養(yǎng)法更加節(jié)省時(shí)間且具有高靈敏度和特異性，因此廣泛用于診斷[40]。Li等[41]用同時(shí)擴(kuò)增和測(cè)試肺炎支原體（SAT-MP）的實(shí)時(shí)方法，通過(guò)靶向核糖體RNA 區(qū)域診斷肺炎支原體，并發(fā)現(xiàn)這種方法可以準(zhǔn)確鑒定肺炎支原體，檢測(cè)范圍為101～107CFU/mL。這種優(yōu)異的靈敏度可能歸因于相同濃度的肺炎支原體的rRNA水平高于DNA。此外，SAT-MP 的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)比PCR 更有效（SAT-MP 一次反應(yīng)可以產(chǎn)生 100 到1000 倍的擴(kuò)增產(chǎn)物）。SAT-MP 在識(shí)別方面也具有理想的特異性。因?yàn)榉窝字гw的IgM 沒有出現(xiàn)在感染初期階段，應(yīng)用SAT 等新的快速診斷工具來(lái)改善臨床應(yīng)用中的早期診斷和及時(shí)治療至關(guān)重要。此外，SAT-MP 檢測(cè)只需 2～3 h 即可完成。值得注意的是，SAT-MP 擴(kuò)增產(chǎn)物也是RNA，這表明實(shí)驗(yàn)室污染和假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)降低[42]。Ratliff 等[40]通過(guò)實(shí)時(shí) PCR 和 PCR 產(chǎn)物的雙向測(cè)序使用LAMP 技術(shù)，例如在致病基因支原體DNA 測(cè)定中的LAMP 技術(shù)，證明其是臨床環(huán)境下肺炎支原體實(shí)時(shí)PCR 的可接受且成本更低的替代品。Huang[43]等從敏感性（SEN）、特異性（SPE）、陰性似然比（-LR）、陽(yáng)性似然比（+LR）、診斷比值比（DOR）和匯總接受者操作特征（SROC）等方面匯總分析了高水平文獻(xiàn)，最后得出基于核酸序列的擴(kuò)增是診斷肺炎支原體感染的可靠技術(shù)。

2 結(jié)語(yǔ)

肺炎支原體是臨床上重要的病原體，定期流行[44]。近年來(lái)，在肺炎支原體呼吸道感染的診斷方面取得了重大進(jìn)展，但對(duì)于肺炎支原體在呼吸道和其他感染中的作用仍有待深入研究。為了防止進(jìn)一步傳播到社區(qū)，需要一種快速簡(jiǎn)單的診斷工具。通過(guò)培養(yǎng)分離或配對(duì)血清樣品檢測(cè)肺炎支原體需要時(shí)間，并且在一般醫(yī)療機(jī)構(gòu)中培養(yǎng)物分離是不可行的。分子生物學(xué)方法，例如PCR測(cè)試和LAMP 方法需要昂貴的設(shè)備，并且對(duì)通常性診斷肺炎支原體感染是不實(shí)用的。許多醫(yī)院的PCR 檢測(cè)經(jīng)常缺乏適當(dāng)?shù)尿?yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化，質(zhì)量控制研究揭示了常見的缺陷，導(dǎo)致假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果[45]。雖然正確和快速檢測(cè)肺炎支原體感染對(duì)于開始適當(dāng)?shù)闹委熤陵P(guān)重要，但是所有新開發(fā)的測(cè)試必須在應(yīng)用之前進(jìn)行廣泛驗(yàn)證。因?yàn)椋_診肺炎支原體感染在臨床上是具有挑戰(zhàn)性的，僅僅根據(jù)臨床體征和癥狀不可能診斷出這種疾病。因此，最佳診斷工具對(duì)于更準(zhǔn)確地診斷和適當(dāng)治療肺炎支原體感染患者并減少濫用抗生素非常重要，需要繼續(xù)進(jìn)行深入研究。