生物鐘基因在骨骼肌中對生肌形成和能量代謝的調控作用

孟凡飛，史套興，宋倫

軍事科學院軍事醫學研究院 軍事認知與腦科學研究所，北京 100850

內在的生理活動與外在的行為活動在時間上與日出日落24 h 的周期相一致的節律活動叫做晝夜節律，這種晝夜節律影響著幾乎所有單細胞生物、植物和動物。晝夜節律產生的遺傳學基礎是生物鐘。哺乳動物的中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），是生物鐘系統的主起搏點[1]，在晝夜節律的產生、維持和調控中起主導作用。過去幾十年中，各種研究已表明生物鐘同樣也存在于心、肺、腎、肝、骨骼肌等外周組織器官，稱之為外周生物鐘[2]。外周生物鐘可以受到中樞生物鐘通過神經、體液等方式直接或間接的調控，同時也能擺脫中樞生物鐘的調控獨立運行，起到生物鐘系統次起搏點的作用。在自然狀態下，生物鐘受到光照、溫度、食物以及化學物質刺激等環境因素的作用影響，生物鐘時相以及相關基因的表達強度發生改變，來與外界環境保持同步。

生物鐘調控網絡中的核心基因包括clock（cir?cadian locomotor output cycles kaput）、bmal1（brain and muscle ARNT-like protein 1）、cry2（cryptochrome 2）、per2（period 2）、rev-erbα（nucle?ar receptor subfamily 1 group D member 1，NR1D1）和rorα（RAR-related orphan receptor α）等[3]。其中在生物鐘調控網絡中起主導作用的是2 個PAS-bHLH 轉錄因子家族的成員CLOCK 和BMAL1。CLOCK 與BMAL1 形成異二聚體，作用于cry、per、rev-erbα、rorα等靶基因的 E 反應元件（E box，CACGTG）并啟動靶基因的轉錄過程[4]。cry基因的表達產物 CRY（Cryptochrome 1 和 2）和per基因的表達產物 PER（Period 1、2 和 3）可形成復合物，隨著蛋白產物的不斷積聚，積累到一定程度時可作為負性元件抑制CLOCK-BMAL1 異二聚體的轉錄活性，進而抑制cry和per基因的轉錄[5]。同時CLOCK-BMAL1 異二聚體也可以誘導視黃酸相關的孤束核受體 REV-ERBα（NR1D1）和 RORα（NR1F1）的表達，REV-ERBα可以與bmal1啟動子區結合阻遏BMAL1 的表達，RORα可以作為正向調節因子促進BMAL1 的表達[6]。

1 骨骼肌中相關生物鐘基因的表達

骨骼肌兼負運動、代謝、內分泌等多重生理功能，其功能機制涉及中樞生物鐘的直接調控與其內部自身內源性生物鐘的自我調控。骨骼肌晝夜節律現象的存在是從大鼠骨骼肌蛋白質合成存在24 h 的周期性變化中首次發現的，之后骨骼肌中晝夜節律的振蕩器被Zylka 等提出[7]。2007年第一個骨骼肌生理節律轉錄組被Takahashi 提出，在小鼠中有215 個、大鼠中有107 個基因的表達存在晝夜節律性[8]。這些基因不僅包括在骨骼肌中起主要調控作用的生物鐘基因bmal1、cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相關的鐘控基因dbp（al?bumin D-site-binding protein）和tef1（thyrotroph embryonic factor 1），同時也包括與骨骼肌功能相關的基因myod1（myogenic determination gene 1）等以及與骨骼肌能量代謝相關的基因pgc-1β（proliferator-activated receptor-γ coactivator 1β）、pdk4（pyruvate dehydrogenase kinase-4）等。

生物鐘基因對骨骼肌生理功能的調控作用包括肌肉生長和維持、收縮功能、結構組織、葡萄糖代謝和能量生成[9]。利用整體或骨骼肌局部生物鐘基因缺陷技術構建的小鼠模型為我們提供了遺傳學工具來研究生物鐘基因環路在骨骼肌中的功能機制。clock基因缺陷小鼠由于線粒體含量減少、線粒體活力下降以及非正常線粒體數量增加，表現出了骨骼肌肌力和運動耐力的下降，同時由于肌動蛋白、肌球蛋白和肌聯蛋白表達的減少造成了骨骼肌結構的變化[10]。有研究表明，BMAL1 是骨骼肌增殖、分化、生肌祖細胞再生的正向調控因子。在bmal1基因缺陷小鼠模型中，除了一些晝夜節律行為和一些節律代謝活動的改變，還會出現骨骼肌纖維直徑的減小、肌纖維類型的轉變、肌節結構的改變、骨骼肌對胰島素敏感性的降低；bmal1基因缺陷小鼠從8 周齡開始就已經表現出骨骼肌重量的降低，同時肌衛星細胞的增殖能力達到峰值，在40 周齡時基因缺陷小鼠不僅表現出壽命的降低，同時骨骼肌重量也出現降低，低至正常小鼠骨骼肌重量的一半[11]。rev-erbα基因缺陷的小鼠會影響骨骼肌細胞的分化，出現糖脂代謝平衡的紊亂，同時由于線粒體活性的下降和骨骼肌內自噬反應的增強導致小鼠骨骼肌運動能力減弱[12-14]。

2 生物鐘基因對骨骼肌生肌形成的調控

骨骼肌是胚胎發育過程中最早形成的組織之一，是由體節細胞經過增殖、遷移、分化而形成。構成骨骼肌的基本單位是肌纖維，肌纖維的類型、直徑、密度、肌節長度等都決定了骨骼肌的收縮力度、運動耐力等生理功能。生肌決定因子（myogenic determination gene，MyoD）在骨骼肌的生長發育過程中起到了決定作用[15]。生肌決定因子家族不僅與哺乳動物胚胎期肌細胞的增殖、分化、融合、肌纖維數量和體積的增大有關，還可以激活肌衛星細胞，將成纖維細胞、平滑肌細胞等轉化為骨骼肌細胞。MyoD 家族主要包括4 個成員，分別是生肌決定因子（MyoD）、肌細胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）和生肌因子 6（Myf6）[16]。

生物鐘基因對骨骼肌結構和功能的調控機制之一是BMAL1/CLOCK 異二聚體作用于myod1啟動子區E 盒（E-box），從而介導了myod1的節律性振蕩表達。轉錄組學分析表明，盡管MyoD1 在野生型小鼠骨骼肌中呈現振蕩表達，但這種振蕩表達在clock以及bmal1基因缺陷小鼠中均消失。然而，在clock和bmal1基因缺陷小鼠中雖然MyoD1 的振蕩表達受到影響，但表型上骨骼肌的生肌形成過程是正常的，這就說明存在某種相應的補償機制，這種補償機制很可能是其他的生肌調節因子例如Myf5 發揮了補償作用[17-18]。在馬和斑馬魚的骨骼肌中，Myf6（Mrf4）的表達是隨著BMAL1 和CLOCK 表達時相的變化而變化的，這說明其他的生肌調節因子也可能直接受到生物鐘基因的調控,對骨骼肌生肌過程產生影響。

BMAL1/CLOCK 異二聚體除了直接調控MyoD1 的表達，也有報道發現BMAL1 通過轉錄水平調控Wnt 信號通路中的關鍵因子來調控成肌細胞的分化。事實上bmal1基因缺陷小鼠在受到例如凍傷等創傷后，出現骨骼肌再生缺陷和骨骼肌修復的減弱，肌衛星細胞開始增殖分化，但肌衛星細胞的增殖能力明顯減弱，這其中部分是由于BMAL1 表達的抑制造成Wnt 信號通路中關鍵因子表達的抑制。在bmal1基因缺陷小鼠的成肌細胞中，通過激活Wnt 信號通路的表達活性可以部分恢復成肌細胞的分化。這說明在胚胎形成過程中，Wnt 信號通路對骨骼肌細胞分化起到了一定作用。

在成肌細胞分化過程中BMAL1 表達不斷增加，在成肌細胞退出細胞周期并分化時BMAL1 的阻遏物REV-ERBα的表達就會受到抑制[19]。在小鼠C2C12 肌源性細胞系中，過表達REV-ERBα可以抑制成肌細胞的分化，MyoD1、MyoG 及肌節細胞中的α肌動蛋白的表達受到抑制。與此同時，RORα 結合與 REV-ERBα 相同的基因啟 動子序列，激活靶基因的表達[20]。因此，REV-ERBα 與RORα都在肌源性分化過程中發揮重要作用。

一旦細胞進入生肌形成過程，都會發生分化、融合并表達肌球蛋白等特異性功能蛋白。生物鐘基因對成肌細胞的融合以及對骨骼肌功能的影響報道較少。McCarthy 等已經證明了編碼骨骼肌收縮基因的表達蛋白是具有晝夜節律的，其中某些基因編碼因子如肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白在clock基因缺陷小鼠中是明顯下調的[21]。鐘基因在骨骼肌纖維形成與轉化以及收縮功能的建立等方面的貢獻仍須深入研究。

3 生物鐘基因對骨骼肌能量代謝的調控

生物鐘基因可以調控機體內的能量代謝過程，生物節律的紊亂往往對這一調控過程產生影響，造成機體內能量代謝自穩態的失衡，進而導致肥胖、胰島素抵抗等相應癥狀的出現。在哺乳動物中，骨骼肌是糖脂代謝的主要器官，生物鐘對骨骼肌能量代謝的調控是機體能量代謝反應的重要組成部分。生物鐘基因缺陷動物模型會出現骨骼肌能量代謝的紊亂。骨骼肌氧化分解碳水化合物和脂肪酸的過程也存在晝夜節律性，同時在培養的骨骼肌細胞中發現葡萄糖的攝取也存在晝夜節律[22]。bmal1和clock基因缺陷小鼠的葡萄糖和脂質晝夜節律性變化消失。clock基因缺陷小鼠長期飼養后會出現肥胖、高血糖的表現[23]。此外，bmal1、per1/2雙缺陷小鼠和cry1/2雙缺陷小鼠會出現葡萄糖不耐癥[24-25]。

組蛋白去乙酰基轉移酶Sirtuin-1（Sirt1）在培養的肌管細胞中可調節葡萄糖氧化和脂肪酸氧化反應[26]。CLOCK∶BMAL1 異二聚體上調NAMPT的表達，NAMPT 可介導NAD+的合成并表現出節律性。由于NAD+是Sirt1 的重要輔助因子，因此NAD+介導了Sirt1 活性的晝夜節律變化[27]。Sirt1通過使BMAL1 去乙酰化，降低了CLOCK∶BMAL1異二聚體的轉錄活性，從而使其靶基因表達受抑。另外，Sirt1 可使PER2 去乙酰化并促進其降解[28]。因此，Sirt1 是將鐘基因與骨骼肌能量代謝聯系起來的一個關鍵因子。LKB1（肝激酶B1）在AMP/ATP 比增加時激活AMPK 能量代謝通路。AMPK 通過誘導Sirt1 的去乙酰基轉移酶活性介導PGC-1α（過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活劑1α）的去乙酰化，而PGC-1α是調節骨骼肌中線粒體的合成與氧化呼吸的關鍵信號分子[29]。不同環境刺激（例如運動或禁食/進食）都可以通過調節骨骼肌中AMP/ATP 和NAD+/NADH 的比例分別控制AMPK 和Sirt1 的活性，進而通過靶向PGC-1α調節骨骼肌中的線粒體活性并對骨骼肌能量代謝產生影響[30]。

晝夜節律抑制性基因rev-erbα在骨骼肌的能量代謝過程中同樣發揮重要作用。在骨骼肌中發現rev-erbα在氧化纖維中高表達并通過抑制線粒體自噬來促進骨骼肌的氧化能力[31]。作為配體依賴性核受體，REV-ERBα可受合成的配體調節，REV-ERBα的合成激動劑在小鼠中表現出抗肥胖和降脂功效。通過合成激動劑激活REV-ERBα可以誘導脂肪酸氧化，抑制骨骼肌中的脂質合成基因，REV-ERBα可能在體內起到降脂的重要作用[32]。研究表明REV-ERBα可以促進葡萄糖的優先使用，減少脂質的利用，rev-erbα基因缺陷小鼠表現出輕度高血糖癥和脂肪酸利用增加[12]。

4 結語

目前生物鐘基因對骨骼肌中生肌形成和能量代謝的調控已經得到眾多研究者的認同，但研究方向大都集中在BMAL1∶CLOCK 異二聚體的調控作用，對于骨骼肌中表達的其他生物鐘基因cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相關鐘控基因dbp和tef1的研究相對較少。基于生物鐘基因對生肌形成和能量代謝的研究，我們可以設想這些鐘基因及鐘控基因可以獨立抑或與BMAL1∶CLOCK 異二聚體共同發揮重要的調控作用，構成生物鐘基因對骨骼肌的調控網絡。同時，機體的能量代謝也是在骨骼肌、肝臟、脂肪等產能器官相互協同作用下進行，我們是否可以找尋作為產能器官的外周生物鐘與SCN 中樞生物鐘之間的關系，建立起在生物鐘主導下的全身能量代謝網絡，從而更全面地分析生物鐘對機體能量代謝的調控。另一方面，人體長期處于睡眠剝奪狀態或睡眠時間不規律都會造成人體節律紊亂，引起生物鐘基因在骨骼肌中表達的改變，從而對骨骼肌生理運動功能以及能量代謝造成影響，進而降低人體作業能力。生物鐘基因調控的生肌調節因子和糖脂代謝的關鍵酶可以作為未來改善睡眠節律紊亂造成的作業能力下降的潛在作用靶點，相關干預藥物的研發具有十分重要的現實意義。