癌相關成纖維細胞的特性及其調控腫瘤進程的研究進展

萬令飛，楊慧，葛晨，劉蘊慧，岳文，裴雪濤，閻新龍

1.北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 衛生勤務與血液研究所軍事再生醫學研究室，北京 100850；3.華南生物醫藥研究院 華南干細胞與再生醫學研究中心，廣東 廣州 510005

癌相關成纖維細胞（cancer-associated fibro?blasts，CAF）是腫瘤組織中活化的成纖維細胞，作為腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中重要的細胞組成部分，能夠分泌多種活性因子參與腫瘤微環境的調控，在腫瘤的增殖與侵襲轉移、腫瘤微血管的生成、腫瘤細胞的耐藥性、介導腫瘤免疫逃逸等多個方面發揮著重要作用。

1 癌相關成纖維細胞的定義

對于CAF 的確切定義目前還存在許多爭議，主要原因是CAF 與基質中其他細胞，如成纖維細胞、肌成纖維細胞、間充質干細胞共享多種標志物[1]，因此在腫瘤微環境中，CAF 與正常成纖維細胞之間的差異，通常是根據功能性來定義，而不是由個別特異性標記基因定義。另外，CAF 的多種來源也決定了尋找一種確切的特異性標志成為挑戰，因而定義CAF 成了極其關鍵的問題。

1.1 CAF的表型

惡性腫瘤中的CAF 與來源于正常組織的成纖維細胞在表型上差異較大。CAF 具有更強的增殖能力，生成更多的膠原蛋白，分泌生長因子和其他細胞外基質活性因子。與正常的成纖維細胞相比，從胃癌中提取的CAF 表現出更強的增殖與遷移能力[2]。

1.2 CAF的特異性標記

常用于定義CAF 的標志物有α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）、成纖維細胞特異性蛋白（fibroblast specific protein，FSP）和血小板衍生生長因子受體β（platelet de?rived growth factor receptor-β，PDGFRβ）。盡管人們提出了多種標記基因和蛋白來定義CAF，但現在發現這些標記不能完全標記所有的CAF，其中一些標記不是CAF 所獨有的。在某些情況下，例如來自8 對患者結腸癌的CAF 與正常組織的成纖維細胞相比，正常的成纖維細胞比CAF 表達更高的α-SMA[3]，并且在其他細胞類型如心臟細胞中也能檢測到α-SMA 的表達[4]。FAP 也不是CAF獨有的，在小鼠的多個正常組織中均發現了FAP陽性的基質細胞[5]，而在一些CD45+免疫細胞[6]、癌相關血管周細胞[7]中，也能夠檢測到FAP 的表達。

以上證據表明，迄今還沒有一個確切的特異性標記能夠將CAF 與其他細胞區分，此限制將大大阻礙對CAF 的功能和機理的認識，以及開發靶向CAF 的抗腫瘤治療的研究進展。

2 CAF的來源

圍繞CAF 的來源有幾種理論，但目前仍有爭議，但越來越多的研究報告了幾種細胞作為CAF的來源：①常駐組織成纖維細胞，組織間質中的正常成纖維細胞在腫瘤細胞分泌的生長因子和細胞因子刺激下活化，是CAF 最主要的來源；②脂肪細胞；③血管周細胞；④上皮細胞與內皮細胞分別通過上皮間質、內皮間質轉化為CAF；⑤骨髓間充質干細胞通過遷移至腫瘤基質中，被腫瘤活化為CAF。

2.1 常駐組織成纖維細胞

最常見的觀點認為CAF 來源于常駐組織成纖維細胞。研究表明，腫瘤來源的外泌體能夠通過激活TGF-β信號通路，促進成纖維細胞分化為CAF[8]，癌細胞還能通過 miRNA（miR-31、miR-214和miR-155）的作用將正常成纖維細胞誘導為CAF[9]。在前列腺癌中，腫瘤組織募集骨髓來源的間充質干細胞，進而分泌TGF-β1，將正常的成纖維細胞轉化為更多的CAF[10]。另外，靜息狀態的胰腺星狀細胞和肝星狀細胞在被鄰近的腫瘤細胞激活后，表達α-SMA 蛋白，獲得 CAF 表型[11-12]。

2.2 脂肪細胞

在腫瘤組織中也能觀察到大量的脂肪細胞，其中脂肪干細胞與癌細胞相鄰，直接與腫瘤細胞相互作用。脂肪細胞被轉化為CAF[13-14]，將用綠色熒光蛋白標記的脂肪組織與鼠乳腺癌細胞注射到小鼠皮下，能觀察到脂肪細胞被募集到腫瘤微環境中并表達α-SMA，獲得CAF 表型[15]。

2.3 周細胞

周細胞與內皮細胞緊密結合，在維持血管和血管生成中起重要作用[16-17]。周細胞不僅保留了祖細胞的特征，在病理條件下還可以分化為成纖維細胞。胃癌細胞通過外泌體激活周細胞中的PI3K/AKT 和MEK/ERK 途徑，誘導其向 CAF 轉化[18]。

2.4 上皮細胞與內皮細胞

上皮間質轉化是指細胞從具有緊密連接的上皮表型轉變為具有松散的細胞-細胞黏附的間質細胞[19]，被認為是上皮癌轉移的潛在機制。

需要注意的是，癌細胞與CAF 中的遺傳改變很少一致，這表明腫瘤中的間質細胞只有一小部分來源于腫瘤細胞[20]。內皮細胞能夠通過內皮-間質轉化轉化為成纖維細胞樣細胞，Zeisberg 等發現TGF-β1 能夠誘導內皮細胞發生表型轉化為成纖維細胞樣，并且這種EndMT 與FSP1 的表達與CD31/PECAM 的 下調 有關[21]。

2.5 骨髓間充質干細胞

間充質干細胞（MSC）被認為是另一種CAF 前體細胞。Mishara 等證明將人骨髓間充質干細胞（BM-MSC）長時間暴露于腫瘤條件培養基從而獲得CAF 的功能特性，包括持續表達基質衍生因子1（SDF-1）、α-SMA 及 FSP，并且在體內、外能夠促進腫瘤增殖[22]。在幽門螺桿菌誘導的小鼠胃癌模型中，研究者用α-SMA-啟動子報告載體示蹤發現，至少20%的CAF 起源于BM-MSC[23]。另有研究者向荷瘤小鼠注射BM-MSC，也證明其可以分化為CAF[24]。與此相類似，研究者證明PDGFRα陽性的CAF 來源于MSC[25]。腫瘤來源的GRP78 通過激活TGF-β/Smad 信號通路引起了BM-MSC 向CAF 分化[26]。

總之，CAF 的起源尚未明了，深入探究各種細胞轉化為CAF 的機制，將有助于提高我們對不同CAF 起源的認識，促進了解不同的CAF 的表型和功能。

3 CAF的異質性

近年來隨著對CAF 群體了解的深入，越來越多的證據表明CAF 群體中存在著不同表型的亞群，不同的亞群在腫瘤發生發展過程中可能扮演著不同的角色。

3.1 表型異質性

例如常用于鑒定CAF 的標記α-SMA 和FAP等，僅僅是因為其在CAF 中高表達，而非特異性表達。人們還發現在CAF 群體內部，這些常用的標記也并非總是能夠特異標記CAF。研究者證明腫瘤微環境中CAF 的一些亞群表達FAP，而在其他的CAF 亞群中卻沒有FAP 的表達[27]，這對于將FAP 當作潛在臨床試驗靶標無疑是一個挑戰。另一個常用的CAF 標志α-SMA，研究者在胰腺導管腺癌中發現存在一個CAF 亞群，其在旁分泌因子誘導下，從成肌纖維樣細胞轉變為炎癥樣的 CAF，導致α-SMA 表達量大幅下降[28]。

3.2 功能異質性

在胰腺導管腺癌中發現2 個CAF 亞群，鄰近腫瘤細胞的CAF 高表達α-SMA，生成細胞基質；而遠離腫瘤細胞的CAF 低表達α-SMA，并且分泌IL-6 和其他炎性因子[28]。這2 種CAF 分別被命名為 myoCAF 和 iCAF。

單細胞RNA 測序技術的發展，使得在單細胞水平上定量分析細胞轉錄組的差異成為可能，克服了大批量RNA 測序數據中掩蓋細胞亞群的問題。研究者利用單細胞RNA 測序技術，在小鼠乳腺癌模型中，通過分析CAF 亞群獨有的基因，將CAF 分為4 群，分別是起源于血管周細胞的vCAF亞群；來源于常駐組織成纖維細胞的mCAF 亞群；與vCAF 重疊，但具有高增殖能力的cCAF 亞群；與腫瘤上皮間質轉換的dCAF[29]，這為研究乳腺癌CAF 的異質性提供了有力的證據。在乳腺癌轉移性腋窩淋巴結轉移瘤中，研究者將CAF 分為4個亞群，其中 CAF-S1（FAPHighCD29Med-Highα-SMAHigh?PDPNHighPDGFRβHigh）和 CAF-S4（FAPLow-MedCD29Highα-SMAHighPDPNLowPDGFRβMed）亞群與乳腺癌轉移擴散有關[30]，表明CAF 亞群在轉移性擴散中表現出獨特的功能，為乳腺癌的精準治療提供了進一步的證據。

4 CAF在腫瘤中的作用

活化的CAF 不僅可通過合成細胞外基質（ex?tracellular matrix，ECM）組分（如膠原蛋白和纖連蛋白等）形成基質結構框架，還可直接與癌細胞和其他微環境細胞發生相互作用。

4.1 CAF促進腫瘤細胞增殖和轉移

CAF 促進腫瘤功能的機制，最常見體現在其與癌細胞之間的旁分泌信號傳導，其中CAF 分泌生長因子和細胞趨化因子，如IL-6、HGF、EGF、IGF、SDF-1 等[31]促進腫瘤細胞的增殖與轉移能力，從而促進腫瘤的發生發展。同時腫瘤細胞也能分泌細胞因子激活CAF，進而促進腫瘤細胞自身的侵襲性[32]。另外CAF 可以通過釋放外泌體作用于腫瘤細胞，促進腫瘤進程[33]，在口腔鱗狀細胞癌中，CAF 分泌的外泌體將miR-382-5p 轉運至腫瘤細胞中，促進口腔腫瘤細胞遷移和侵襲[34]。

重塑細胞外基質是CAF 促進腫瘤遷移的另一種方式[35-36]。在前列腺癌中，CAF 可以通過高水平表達纖連蛋白（Fn）而改變ECM 的結構，使得前列腺癌細胞能夠通過整聯蛋白在ECM 中定向遷移，類似現象也發生在頭頸癌[37]與乳腺癌中[38]。

4.2 CAF促進腫瘤細胞的耐藥性

研究表明，CAF 能夠提高癌細胞對化療藥物的耐藥性[39-40]。最常見的解釋是，CAF 分泌外泌體作用于腫瘤細胞，激活下游信號通路，從而降低腫瘤細胞對藥物的敏感性。在胃癌中，CAF 來源的外泌體攜帶miR-522 作用于胃癌細胞，抑制ALOX15 并減少脂質ROS（一種由鐵依賴的脂質過氧化物）在腫瘤細胞中的積累，最終導致藥物敏感性降低[41]。CAF 分泌的外泌體miR-196a 通過靶向CDKN1B 和ING5，在頭頸癌中賦予腫瘤細胞順鉑耐藥性[42]。CAF 來源的外泌體miR-92A-3p 激活結腸直腸癌細胞Wnt/β-catenin 途徑并抑制線粒體凋亡，從而促進結腸直腸癌中腫瘤干細胞的干性基因表達與化療耐藥性[43]。CAF 促進腫瘤細胞化療耐藥性的另一種方式是通過促進腫瘤細胞中腫瘤干細胞（CSC）亞群存活。CSC 被認為是腫瘤細胞中具有腫瘤干性的亞群，與化療后腫瘤復發密切相關[44-45]，研究證明，CAF 通過釋放IL-17A 激活結直腸癌干細胞的NF-κB 通路及其下游靶標ERK1/2，增強了其對化療的耐藥性[46]。這為增加腫瘤細胞化療敏感性提供了另一種思路，因為大多數增加化療敏感性的方法專注于阻斷腫瘤細胞自身的信號通路，而忽略了微環境對于腫瘤干細胞的作用。

4.3 CAF促進腫瘤中血管形成

腫瘤的生長依賴于腫瘤組織中的血管生成，CAF 可以通過分泌 VEGF、FGF 和 IL-6 等多種促血管生成因子，有效促進腫瘤組織的血管生成[47]，也能通過SDF-1 將內皮祖細胞招募到腫瘤組織中，促進血管生成[48]。對于不依賴VEGF 的血管生成，也有報道稱miR-205/YAP 介導的CAF 活化也能促進血管生成[49]，這將有助于進一步了解腫瘤微環境中CAF 對于血管生成的作用。

4.4 CAF參與腫瘤微環境中的免疫調節

CAF 還能夠直接參與腫瘤微環境中的免疫調節，FAP+CAF 能夠分泌趨化因子CXCL12，促使胰腺導管腺癌小鼠對免疫檢查點拮抗劑失去響應，發生免疫逃逸[50]。CAF 還能影響腫瘤相關巨噬細胞（TAM）的功能[51]，CAF 通過分泌 CXCL12/SDF1、M-SCF 和IL-6，促進募集巨噬細胞并誘導其分化為免疫抑制表型的Ⅱ型巨噬細胞[52-55]。CAF 還與腫瘤微環境中嗜中性粒細胞的募集有關，中性粒細胞通過 CAF 分泌的 CXCL1、CXCL2 和 CXCL5 被招募至腫瘤組織內，釋放活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、蛋白酶等影響腫瘤的發生。CAF 還可以影響先天免疫細胞——自然殺傷（NK）細胞的活性，CAF 分泌的 TGF-β1 能夠使得依賴于 TGFβ1的NKp30 表達下調，顯著抑制NK 細胞介導的免疫殺傷[56-57]。還有研究證明，CAF 能夠誘導骨髓來源的抑制細胞（MDSC）生成和激活，促進免疫抑制，從而為癌癥的發生發展創造有利條件[58-60]。

4.5 CAF抑制腫瘤

盡管CAF 有強大的促腫瘤作用，但也有報道稱某些CAF 亞群具有腫瘤抑制功能。CD146-CAF 可賦予乳腺癌細胞他莫昔芬耐藥性，而CD146+CAF 則能夠逆轉這種表型，提高藥物敏感性[61]。在胰腺導管腺癌小鼠模型中敲除α-SMA+CAF 時，反而促進腫瘤發生，導致生存率下降[62]。這些證據表明，在某些腫瘤中存在抑制腫瘤細胞的CAF 亞群，非選擇性地靶向整個CAF 群體可能效果差甚至起相反結果。找到更為可靠的CAF特異性標記，區分在腫瘤中發揮促進或抑制功能的CAF 亞群，才能更有針對性地進行靶向治療。

5 靶向CAF的抗腫瘤治療

由于腫瘤微環境中CAF 發揮的重要作用，越來越多的研究將CAF 視為癌癥患者的治療靶標。

5.1 靶向CAF下游信號通路的抗腫瘤治療

由于CAF 分泌多種調控因子，可以通過阻斷來自CAF 的信號，從而減少其對腫瘤細胞的正向調控作用。涉及腫瘤微環境中CAF 的信號分子從功能上大致分為2 類。一類是招募和激活CAF的分子，如IL-6，其能激活下游JAK1/STAT3 信號通路從而激活CAF[63]，靶向IL-6、IL-6 受體或JAK的藥物已獲美國食品和藥物管理局批準[64]。而通過阻斷CAF 中的PDGFR 信號傳導，顯著抑制FGF2 和FGF7 的表達，可抑制腫瘤微環境中血管生成和腫瘤增殖[65]。另一類是CAF 衍生的細胞因子與趨化因子。例如，CAF 是許多腫瘤中趨化因子CXCL12 的主要來源，靶向阻斷CXCL12 作用于腫瘤細胞可以促進T 細胞募集，并與檢查點拮抗劑α-PD-L1 協同作用達到抑制腫瘤[66-67]。

5.2 靶向CAF亞群的抗腫瘤治療

基于前述CAF 的異質性，最理想的情況是靶向促進腫瘤的CAF 亞群，將其重編程為正常的成纖維細胞或抗腫瘤的CAF 表型。研究者利用卡泊三醇作為維生素D 受體的配體，能夠將活化的CAF 恢復到靜息狀態，從而增強了化療藥物的功效[68]。在乳腺癌中，CD10+GPR77+CAF 被認為是維持腫瘤細胞干性并促進腫瘤形成和化療耐藥性的一個亞群，中和阻斷GPR77 能夠顯著抑制腫瘤的進程[69]。這些證據凸顯了定義CAF 亞群以及探究其在腫瘤發生過程中所發揮功能的重要性。

隨著對CAF 介導的多種削弱抗腫瘤免疫作用認識的加深，針對CAF 的免疫療法將是很有吸引力的選擇。

綜上所述，CAF 通過參與腫瘤微環境中的復雜調控，促進腫瘤細胞的增殖和轉移能力，提高腫瘤微環境中的免疫抑制，最終造成腫瘤的發生發展。近年來，隨著對CAF 與腫瘤和腫瘤微環境中免疫細胞相互作用機制的深入研究，越來越多的證據表明CAF 有望成為抗癌治療的靶點。但目前仍然存在許多亟待解決的問題，例如尋找CAF 特異性標志物，探尋不同CAF 亞群的分類、特性及其在腫瘤中的作用等，亟須對CAF 進行深入系統的研究。