熒光染色法和KOH濕片法在頭癬診斷中的應用

葉文正，方木平

武漢科技大學附屬孝感醫院皮膚科，湖北 孝感 432000

頭癬是由皮膚癬菌感染頭皮和毛發所引起的疾病，頭癬多累及兒童，成人較少見[1-2]，致病菌只見于毛癬菌屬和小孢子菌屬，頭癬根據致病菌種類和宿主反應不同可以分為黃癬、白癬、黑點癬及膿癬[3]，對于所有侵及毛發的皮膚癬菌來說，其入侵形式不同可分為發內型和發外型感染[4]。準確可靠的病原學檢查是診斷頭癬的重要依據[5]，有利于及時治療且減少永久性瘢痕性脫發的發生，常規的真菌鏡檢采用的是10%的KOH濕片法，但因背景雜亂，雜質及氣泡干擾等導致發內孢子及菌絲鑒別困難，且標本溶解需要一定時間，易出現假陽性和假陰性結果。本研究旨在通過對比熒光染色法、KOH濕片法檢出頭癬的陽性率和閱片時間，比較兩種方法的檢測在頭癬診斷中的優越性。

1 材料與方法

1.1 檢測標本 選取2017年2月至2019年1月在武漢科技大學附屬孝感醫院皮膚科門診就診擬診頭癬患者82例，其中兒童69例，成人13例；男性45例，女性37例。取材標本同時采用熒光染色法、KOH濕片法和真菌培養法進行檢測。

1.2 試劑及檢測儀器 10%KOH(江蘇永華化學科技有限公司)溶液自配，立特晰真菌熒光染色液(安徽德萊康生物醫療科技有限公司生產)，沙氏培養基(上海博微生物科技有限公司)，儀器采用奧林巴斯顯微鏡和徠卡熒光顯微鏡。

1.3 取材及染色方法

1.3.1 取材 先用75%的酒精消毒患者頭部皮疹，用鑷子拔取斷發置于載玻片上，如有鱗屑并用鈍頭刀片刮取鱗屑一起置于載玻片上，所有標本平均分為3份。

1.3.2 KOH濕片法 隨機選取一份標本置于載玻片上，加10%KOH溶液一滴，蓋上蓋玻片，在酒精燈火焰上方快速通過2~3次，注意不要沸騰，然后輕壓蓋玻片，用吸水紙吸去多余的溶液，置奧林巴斯顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 熒光染色法 隨機選取第二份標本滴加一滴熒光染色液，蓋上蓋玻片，輕壓，用吸水紙吸去多余的染色液，置徠卡熒光顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.3.4 真菌培養 將第三份標本接種在沙堡培養基上，置26℃培養箱培養1~2周，觀察菌落形態特征以及生化反應，鑒定菌種。

1.4 觀察指標 對比熒光染色法和KOH濕片法鏡下觀測效果，分別比較其檢出陽性率以及平均閱片時間，并以培養為參考標準比較兩種方法的靈敏度和特異度。

1.5 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差s)表示，兩樣本均數比較采用配對設計t檢驗，計數資料使用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鏡下觀察 熒光染色后發內鏈狀孢子清晰可見，在低倍顯微鏡下即顯示出明亮的藍色輪廓(圖1A)，KOH濕片法則視野昏暗，背景雜亂且對比度低，在和熒光顯微鏡相同的倍數下無法有效辨別發內孢子(圖1B)；在高倍視野下發內鏈狀孢子顯示出更加清晰的熒光輪廓，菌體清晰可辨(圖1C)，在相同高倍顯微鏡下，KOH濕片法孢子則呈現無色透明或者淡綠色折光，和背景反差小，與雜質、氣泡等不易分辨(圖1D)。

圖1 低倍和高倍顯微鏡下發內孢子分別在熒光染色和KOH濕片法中的特點

2.2 兩種方法檢測頭癬陽性率、靈敏度和特異度比較 熒光染色法和KOH濕片法檢測陽性率分別為80.49%(66例)、63.41%(52例)，熒光染色法陽性率高于KOH濕片法，陽性率差異有統計學意義(χ2=5.92，P<0.05)。82例頭癬患者中，培養陽性61例，其中犬小孢子菌38例、紫色毛癬菌10例、須癬毛癬菌5例、斷發毛癬菌4例、紅色毛癬菌2例、石膏樣小孢子菌2例，培養陽性的61例患者中，熒光染色法陽性55例，陰性6例(9.84%)；KOH濕片法陽性44例，陰性17例(27.87%)，兩種檢測方法漏診率比較差異有統計學意義(χ2=6.48，P<0.05)；熒光染色靈敏度90.16%，特異度47.62%，KOH濕片法靈敏度72.13%，特異度61.90%，見表1。

2.3 兩種檢測方法和閱片時間比較 熒光染色法和KOH濕片法閱片時間分別為(69.61±9.28)s、(88.76±7.79)s，熒光染色法閱片時間低于KOH濕片法，差異有統計學意義(t=-14.13，P<0.05)。

表1 擬診頭癬患者培養結果及熒光染色法和KOH濕片法檢測結果(例)

3 討論

頭癬是指累及頭發和頭皮的真菌感染，直接鏡檢是檢查淺部真菌形態學的最基本方法，其中KOH濕片法是臨床上直接鏡檢最早和最廣泛的方法[6]，該方法不需要特殊儀器，操作簡單且方便快捷，但缺點是檢測視野背景雜亂，對比度低，特別是在頭癬診斷中，由于部分孢子及菌絲寄生在發內，常規KOH濕片法難以短時間溶解毛發，顯露發內菌絲及孢子，此外，在制片過程中，產生的小氣泡、脂滴和纖維絲等也存在明顯干擾，導致檢出率偏低或造成假陽性和假陰性結果[7]。熒光染色液是一種高純度熒光素和和特定比例的KOH混合溶液，熒光素標記下的幾丁質重組酶能和真菌細胞壁中的幾丁質以及纖維素特異性結合，形成強熒光復合物，在暗視野顯微鏡下，染色后真菌結構發出亮綠色熒光，和背景反差較大，使菌體的分布位置和數量清晰可見。該方法操作簡易，僅需一滴染色液，數秒鐘即可完成，操作過程和KOH濕片法一致，但無需加熱，耗時短且省時省力，結果直觀明了，特別是對于發內外的真菌感染診斷，能夠迅速區分氣泡、脂滴、纖維絲以及菌絲和孢子，短時間內做出確切可靠的診斷，指導臨床及時用藥，防止誤診漏診，造成永久性脫發以及危害患者身心健康[8-10]。

通過對比熒光染色法和KOH濕片法檢測門診擬診為頭癬患者的斷發和鱗屑的陽性率，熒光染色法陽性率和敏感度均高于KOH濕片法，閱片時間低于KOH濕片法，熒光染色漏診率亦低于KOH濕片法，在擬診頭癬的82例患者中，培養陰性例數為21例，在此21例培養陰性患者中，KOH濕片法檢測陰性13例，檢測陽性8例，熒光染色法檢測出11例陽性患者，陽性檢測率高于KOH濕片法，顯示出熒光檢測的優勢。對于較少真菌數量的標本，或者普通KOH濕片法不易發現發內較少的菌絲和孢子的樣本，熒光染色法也能夠做出快速有效且可靠的診斷，因此，熒光染色法陽性檢出率和靈敏度均高于真菌培養和KOH濕片法，閱片時間也低于KOH濕片法，而且在培養陰性的患者中檢出陽性率也高于KOH濕片法，因此熒光染色法在頭癬診斷中有著明顯的優勢。余菁等[11]通過門診收集擬診為手足癬、體股癬和甲真菌病患者總計600例以及馬拉色菌感染的102例患者，通過熒光染色法和KOH濕片法進行比較，得出熒光染色法相比于KOH濕片法可以提高檢出陽性率，減少漏診，縮短閱片時間，岳學蘋等[12]通過運用熒光染色法和KOH濕片法對100例擬診甲真菌病患者進行檢測比較，結果顯示熒光染色法較KOH濕片法方便、快速、準確，徐艷等[13]也通過熒光染色法和KOH濕片法對105例疑診為淺表真菌感染的患者皮損標本進行檢測，結果顯示熒光染色法較KOH濕片法結果更快速、準確，可用于淺部真菌感染的快速診斷。本次研究同樣顯示在頭癬診斷中，相比于KOH濕片法和真菌培養，熒光染色法有更高的陽性檢出率以及較高靈敏度，減少漏診和閱片時間，有較高的應用價值。

綜上所述，在頭癬患者直接鏡檢中，熒光染色法檢查陽性率和閱片時間均優于KOH濕片法，特別是對于菌量少、雜質多且制片質量較低的標本，熒光染色法更為快捷、簡便、高效以及有較高的檢出率和靈敏度，有較好的檢測優勢，對于初學者易于掌握，值得臨床廣泛應用。