基于DNA甲基化的散發性子宮內膜癌生物學標志物的薈萃分析

范宇，王南，高原，王宇，傅少志，文慶蓮

西南醫科大學附屬醫院腫瘤科健康管理部，四川 瀘州 646000

子宮內膜癌是源自女性生殖系統的三種主要腫瘤之一。在許多國家，其發病率高于宮頸癌，并且位于婦科惡性腫瘤的第一位[1-2]。子宮內膜癌患者經常出現陰道異常出血；雖然許多患者在疾病仍然局限于子宮時被診斷出來，但大約30%的患者在其晚期被診斷。大多數用于治療晚期和復發性子宮內膜癌的臨床試驗僅顯示出有限的生存獲益，并且在過去幾年中死亡率急劇增加[3-4]。異常的遺傳學和表觀遺傳學改變已被廣泛認為與子宮內膜癌有關[5-6]。然而，遺傳學標記尚未被證實可用于從整體上鑒定疾病，特別是散發性子宮內膜癌。異常DNA甲基化是被最廣泛研究的表觀遺傳修飾之一，在子宮內膜癌中具有關鍵作用[7-8]。最近已經發現基于基因甲基化的診斷標記，并且已經顯示出用于檢測子宮內膜癌的可能，而異常DNA啟動子甲基化已經被發現是子宮內膜癌的發生早期和廣泛的改變[9]。然而，目前缺乏子宮內膜癌的有效診斷生物標志物，并且迫切需要新穎、準確的標志物。既往的研究已經提示了組織樣本中異常基因甲基化作為子宮內膜癌的潛在診斷生物學標志物的用途，并且其結果令人鼓舞但是具有差異性。因此，需要通過進一步研究來描述不同抑癌基因中DNA甲基化與散發性子宮內膜癌的臨床病理特征間的關聯。因此亟待更新關于DNA甲基化和散發性子宮內膜癌這一主題的薈萃分析，原因如下：研究該主題的一些其他研究和試驗已經發表，因此可以更全面地綜合性分析數據；其他同樣適用于研究DNA甲基化在癌癥特征描述中的影響(前期研究顯示DNA甲基化與臨床病理學特征之間僅存在一個顯著相關性)；子宮內膜癌中潛在的新的抑癌基因已被納入在內。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索 通過系統的文獻檢索，確定了DNA甲基化作為散發性子宮內膜癌早期診斷生物學標志物的研究。本研究在PubMed、EBSCO、Google Scholar和Embase數據庫中搜索了2018年10月31日之前發布的所有相關的英文文章，并使用以下關鍵字組合進行文獻搜索：[tissue(or)sample(or)specimen(or)circulating cell free DNA(or)cfDNA(or)ctDNA(or)circulating tumor DNA(or)circulating tumor cell(or)CTC(or)blood(or)white blood cell(or)serum(or)plasma](and)[endometrial(or)endometrioid(or)endometrium(or)endometria](and)[neoplasm(or)cancer(or)tumor(or)carcinoma(or)adenocarcinoma(or)malignancy](and)[methylation(or)methylated(or)hypermethylation(or)hypomethylation]。兩名研究者獨立地進行了評估并通過文章的標題和摘要進行篩選。本文作者對所有研究進行了評估和討論，直至達到一致的篩選標準。系統回顧和薈萃分析的首選報告項目(preferred reporting items for systematic reviews and meta-analyses，PRISMA)[10]被用作文獻搜索過程的模板。

1.2 納入標準與排除標準 重復的文章在合并數據庫中檢索的文章后被刪除，通過審查標題和摘要進行初步篩選，并且排除了會議摘要、評論和社論，僅有全文形式的原始研究被包括。本研究還排除了不關注組織中DNA甲基化變化，且不是散發性子宮內膜癌檢測/診斷背景的文章。在第一輪審查和排除后，根據以下排除標準進一步全文審查以獲得最終納入文獻：沒有健康正常個體或對照的研究(例如不考慮僅有配對樣本或良性疾病的研究)；不是病例對照研究；沒有報告或無法從公布的數據計算出對散發性子宮內膜癌診斷的敏感性和特異性值的研究；樣本量小(n≤10)的研究；以及基于細胞系或動物模型而不是人類臨床樣本進行的研究。

1.3 數據提取與統計分析 根據紐卡斯爾-渥太華量表(newcastle-ottawa scale，NOS)[11]，兩名研究者獨立審查和評估了符合條件的研究，并且認為被授予五顆星或更多的研究是高質量的。然后，兩位作者使用Cochrane協作工具(Cochrane干預系統評價手冊5.1.0版)的標準化形式提取以下數據：第一作者、出版年份、地區、樣本量、檢測技術、生物標志物、改變類型、診斷敏感性和特異性值以及偏倚風險。使用標準化方法評估以下偏倚風險項目：隨機順序生成、分配隱藏、患者和研究人員雙盲、結果評估盲法、不完整結果數據、選擇性報告和其他偏倚。所有作者通過進一步討論解決了任何分歧。如果沒有明確報告甲基化值，則盡可能從可用的表格或圖中提取信息。通過Meta-DiSc分析[12]診斷變量，如敏感性、特異性、陽性似然比(positive likelihood ratio，PLR)和陰性似然比(negative likelihood ratio，NLR)，診斷比值比(diagnostic odds Ratio，DOR)和受試者工作特性曲線，以評估散發性子宮內膜癌的甲基化基因的診斷價值或準確性。PLR>5.0和NLR<0.2被認為具有臨床意義。DOR代表甲基化基因患者與無甲基化患者相比，子宮內膜癌風險增加。使用Review Manager 5.3分析敏感性和發表偏倚，并使用漏斗圖呈現發表偏倚。當I2>50%時，認為存在顯著的異質性。如果研究之間存在異質性，則使用隨機效應模型合并分析結果；否則采用固定效應模型。

2 結果

2.1 文獻特征 系統文獻檢索的工作流程如圖1所示。PubMed、EBSCO、Google Scholar和Embase的主要檢索發現了1 448篇文章，其中851篇是重復的文章，再對標題、摘要和全文篩選過濾后，最初獲得了134項研究。進一步根據以下標準排除了108項研究：基于使用體外/離體細胞系和人異種移植物13項研究；41項研究沒有健康的正常對照；15項不是病例對照研究；33項研究不可提取或計算診斷靈敏度和特異性；6項研究的樣本量很小(n≤10)。所有納入的研究都集中探討組織DNA甲基化或高甲基化。因此，系統文獻檢索最終獲得了26項研究，包括2 299例參與者(1 676例散發性子宮內膜癌患者和623名正常個體)。沒有患者接受過術前化療、放療或激素治療。納入的研究發表于2001—2018年，分別來自于10個國家或地區(中國、捷克共和國、香港、日本、韓國、荷蘭、俄羅斯、斯洛伐克共和國、臺灣和美國)(表1)。這些研究的樣本量范圍為19~156(中位數87)。18項研究評估了單個基因甲基化的診斷價值，5項研究評估多個基因，其他3項研究評估單基因和組合基因。再者，21項研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation specific PCR，MSP)檢測基因的甲基化情況，3項研究采用結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)，1項采用定量MSP(quantitative methylation-specific PCR，qMSP)，1項采用MSP和COBRA分別用于兩個基因的檢測。DNA甲基化生物學標志物的具體細節及其診斷能力顯示在表2中。所有26篇選擇性納入的文章由兩位研究者進行評估和檢查，并且根據NOS量表觀察到均具有高水平的方法學質量(超過五顆星)。

圖1 文獻檢索流程圖(截至2018年10月31日)

表1 納入研究文獻的主要特征

表2 甲基化生物學標志物的具體細節及其診斷能力

2.2 診斷價值的薈萃分析 本研究評估了每項研究的偏倚風險。每個項目的詳細評估標準和結果分別顯示在表3和圖2中，偏倚風險總結在圖3中。大多數納入研究中偏倚的風險高或不明確。4項研究表明參與者順序是隨機產生的。在69%的研究中報告了所有評估的甲基化生物學標志物的診斷值，表明沒有選擇性報告。9項研究沒有其他偏倚，被定義為低風險。本研究合并了26項研究用于診斷準確性的薈萃分析。合并敏感性和特異性分別為0.92(95%置信區間：0.91~0.94)和0.48(95%置信區間：0.46~0.50)(圖4)。DNA甲基化的存在對于散發性子宮內膜癌的風險具有相對高的診斷能力(曲線下面積=0.8743)(圖5)。陽性擬然比和陰性擬然比分別為1.98(95%置信區間：1.76~2.22)和0.16(95%置信區間：0.11~0.21)，合并診斷比值比為17.64(95%置信區間：11.64~26.74)。在這些研究的診斷薈萃分析中觀察到顯著的異質性(敏感性：I2=70.2%，P<0.001；特異性：I2=86.2%，P<0.001)。根據Spearman相關性分析發現沒有顯著的閾值效應(P=-0.172，P=0.178)。因此，亞組分析(表4)根據五個不同的參數進行：樣本量(≤85與>85)、改變類型(甲基化與高甲基化)、種族(黃種人與白種人)、檢測方法(MSP、COBRA與qMSP)和目標基因(單一、任何一種與兩種基因)。敏感性的低異質性僅在COBRA亞組(敏感性：I2=44.8%，P=0.143)、qMSP亞組(敏感性：I2=0%，P=0.547)、任何一個基因亞組(敏感性：I2=0%，P=0.920)和兩個基因亞組(敏感性：I2=0%，P=1.0)中檢測到；而特異性的低異質性在白種人亞組(特異性：I2=42.1%，P=0.069)和任何一個基因亞組(特異性：I2=0%，P=1.0)中被發現。診斷比值比的亞組分析揭示了高甲基化、COBRA、qMSP和任何一個或兩個基因的同質趨勢(高甲基化：I2=49.9%，P=0.062；COBRA：I2=0%，P=0.871；qMSP：I2=0%，P=0.994；任何一個基因：I2=0%，P=0.998；兩個基因：I2=32.65，P=0.157)。這些結果表明甲基化檢測方法和基因組合的類型可能有助于降低異質性。表4總結了亞組診斷價值的其他指標。基于這些因素的薈萃回歸分析也用于探索可能的異質性來源，如表5所示，只有檢測方法才能顯著改變診斷價值的異質性(P<0.001)。總之，本研究認為檢測方法和基因組合是異質性的主要因素。因此，需要使用不同檢測方法的精心設計的研究來闡明基因甲基化在散發性子宮內膜癌中的診斷作用。

表3 偏倚風險的詳細標準

圖2 偏倚風險匯總(綠色：低風險；黃色：不確定風險；紅色：高風險)

圖3 偏倚風險圖(對偏倚項目每一風險的判斷，以納入研究的百分比表示)

圖4 診斷準確性的森林圖

2.3 散發性子宮內膜癌患者DNA甲基化與臨床病理特征的關系 本研究基于16項不同的研究評估了DNA甲基化與散發性子宮內膜癌患者的幾種臨床病理特征之間的關聯，其中3項涉及多個基因。沒有分析與DNA甲基化相關的年齡，因為不同研究的患者之間無統一的年齡界值。甲基化狀態與淋巴結轉移和腫瘤分期顯著性相關(淋巴結陰性/陽性，合并比值比：0.34，95%置信區間：0.19~0.59，P<0.001；Ⅰ~Ⅱ/Ⅲ~Ⅳ，合并比值比：0.62，95%置信區間：0.45~0.85，P=0.003)(表6)，提示基因甲基化與散發性子宮內膜癌患者的淋巴結轉移和腫瘤分期的風險正相關，因此可能預后相對較差。然而，基因甲基化與體重指數(≤25.9/>25.9，合并比值比：1.04，95%CI：0.44~2.47，P=0.92)、病理類型(子宮內膜樣/其他，合并比值比：0.63，95%CI：0.21~1.88，P=0.41)、組織學分級(G1/G2~3，合并比值比：0.82，95%CI：0.46~1.46，P=0.50)和侵襲(<1/2/≥1/2，合并比值比：0.59，95%CI：0.22~1.57，P=0.29)無顯著相關性，見圖5。

表4 診斷參數的亞組分析

表5 診斷價值的薈萃回歸分析

2.4 敏感性分析和發表偏倚 通過一次移除一項研究，進行敏感性分析以評估結果的穩定性。然而，這并未顯著影響合并比值比或異質性指數，表明本次薈萃分析的穩定性。漏斗圖相對對稱，基本沒有一項研究落在漏斗外(圖6)，這表明在散發性子宮內膜癌患者的基因甲基化薈萃分析中沒有顯著的發表偏倚。

圖5 含95%置信區間的受試者工作特性曲線圖(summary receiver operating characteristic，SROC)

表6 DNA甲基化與臨床病理特征相關性的薈萃分析

圖6 評價發表偏倚的漏斗圖

3 討論

DNA甲基化在既往研究中已經證明可能成為子宮內膜癌的生物學標志物，其在子宮內膜癌和正常組織之間顯示出明顯不同的甲基化模式[39]。DNA甲基化的改變反映了子宮內膜癌發生過程中的基因轉錄變化。根據最近的綜述，許多研究已經探討了子宮內膜癌中不同基因的異常啟動子甲基化[40]。此外，來自一項全基因組甲基化數據的分析提示了DNA甲基化生物學標志物對子宮內膜癌的診斷和預后的效用[41]。盡管與子宮內膜癌相關的DNA甲基化研究目前仍處于臨床前階段，但許多結果提示了其臨床用作診斷、預后和治療反應生物學標志物以及表觀遺傳治療靶點的潛力。然而，盡管P16和RASSF1A的異常甲基化對子宮內膜癌診斷具有一定的敏感性和特異性[42-43]，但是其他基因(例如ER、PR、MLH1、MGMT、APC和CDH1)的異常甲基化已經顯示出用于子宮內膜癌診斷的準確性差異[40]。

本研究基于前期研究，再次評估了散發性子宮內膜癌的甲基化標志物的診斷準確性。總體而言，DNA甲基化對診斷的合并敏感性和特異性分別為0.92和0.48，并且DNA甲基化的存在對于散發性子宮內膜癌的風險具有相對高的診斷能力(曲線下面積=0.8743)，但特異性相對較低(0.48)。就敏感性而言，DNA甲基化是化學穩定的，并且在其他腫瘤中顯示出高靈敏度[44]。目前的證據表明，甲基化基因優于單獨或聯合使用的CA125等血清蛋白標志物，CA125診斷靈敏度僅為40%~80%[45-46]。子宮內膜癌的臨床診斷目前依賴于超聲、磁共振成像和CA125的組合，盡管這些檢查手段都不是完全令人滿意。CA125通常用作卵巢癌的血清標志物，但也被認為是子宮內膜癌良好的預后標志物[45]。循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的存在被認為對某些癌癥具有高度特異性，主要是因為腫瘤DNA中鑒定的體細胞突變不存在于正常DNA中，而基因甲基化可能發生在正常和癌癥DNA中[47]。本研究證實，臨床樣本中DNA甲基化的檢測對子宮內膜癌具有相對較低的診斷特異性(合并特異性：0.48，95%CI：0.46~0.50)，這表明需要更具特異性的甲基化基因。

目前的研究包括基因甲基化或高甲基化改變，這可能導致大多數情況下腫瘤抑制基因的異常沉默。與這些類型的基因改變一致，最常見的甲基化檢測方法是MSP，其具有包括相對高的靈敏度等各種優點[48]。在本次薈萃分析中，多項研究檢測到MLH1、CDH1和RASSF1A基因甲基化。MLH1被確定為異常DNA錯配修復和微衛星不穩定性(microsatelliteinstability，MSI)的原因，其功能障礙可能與Lynch綜合征(也稱為遺傳性非息肉病性結直腸癌綜合征，hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome，HNPCC)有關[49]。盡管在許多子宮內膜癌患者中檢測到MSI，但其突變頻率極低，這表明它可能是MSI陽性子宮內膜癌患者中啟動子異常甲基化的結果[18]。此外，除了qMSP，子宮內膜癌的異常DNA甲基化的診斷價值不受所用技術的顯著影響，表明這種測定可能顯示出更高的特異性。基因甲基化標記物的組合在散發性子宮內膜癌中也顯示出潛在的更高的診斷準確性。

本項研究清楚地表明，檢測基因甲基化模式可以為散發性子宮內膜癌提供高敏感性但低特異性的診斷方式。子宮內膜癌患者中DNA甲基化的存在可預測淋巴結轉移、晚期腫瘤和不佳預后。目前缺乏用于子宮內膜癌診斷和預后的生物學標志物，因此甲基化標志物可用于區分陰道出血異常女性的惡性或非惡性原因。需要尚需進一步的薈萃分析，以使用更為準確的甲基化基因和合適的檢測技術，同時迫切需要利用一致性和標準化方法的更多前瞻性研究來解決這些問題。這項研究還存在一些局限性。首先，由于報告陽性結果的傾向性，可能已經發生選擇偏倚，并且一些選定文獻中相對較小的樣本量也可能導致偏倚。此外，使用不同的MSP引物或設備，以及散發性子宮內膜癌中缺乏廣泛接受的甲基化基因也可能是偏倚的潛在來源。最后，甲基化相關生存預后及來自宮頸刷等其他部位組織的進一步分析可以幫助在子宮內膜癌中找到潛在的DNA甲基化生物學標志物。