吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-脫水葡萄糖醇的方法學(xué)性能評(píng)價(jià)

陳穎，李莎，索明環(huán)，王偉佳

中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東 中山 528403

1,5-脫水葡萄糖醇又稱(chēng)1,5-脫水-D-山梨醇(1,5-anhydroglucitol，1,5-AG)，是自然界存在的多元醇，可反映檢測(cè)前1~2周內(nèi)的平均血糖水平。機(jī)體在高糖狀態(tài)下，葡萄糖會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制1,5-AG在腎小管的重吸收，從而使血清1,5-AG的含量顯著降低[1-2]。近年來(lái)，1,5-AG反映餐后高血糖和短期血糖波動(dòng)的優(yōu)勢(shì)受到廣泛的關(guān)注[3-4]。1,5-AG可作為糖尿病患者診斷和預(yù)測(cè)常見(jiàn)并發(fā)癥的必要補(bǔ)充，其準(zhǔn)確測(cè)定有著重要意義。本研究參考CLSIEP文件和相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]，評(píng)價(jià)吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG的主要分析性能，使其更好地應(yīng)用于臨床，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 選取2019年4~6月來(lái)自廣東省中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院就診人員樣本，無(wú)溶血、乳糜、黃疸等干擾物；其中生物參考區(qū)間驗(yàn)證樣本，男性10例，年齡20~62歲；女性10例，年齡19~62歲，均無(wú)任何疾病史。

1.2 試劑與儀器 1,5-AG測(cè)定試劑盒、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品均由北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司提供。儀器為德國(guó)西門(mén)子ADVIA2400生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 參考EP5-A2文件進(jìn)行確認(rèn)。批內(nèi)精密度：選取低值、高值新鮮血清1,5-AG樣本，重復(fù)檢測(cè)20次。批間精密度：選取低值、高值質(zhì)控品，分成5份，每天測(cè)4次，連續(xù)測(cè)5 d，分別計(jì)算其平均值()、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)。

1.3.2 正確度驗(yàn)證 測(cè)定另一個(gè)批號(hào)1,5-AG校準(zhǔn)品低值(7.0μg/mL)和高值(25μg/mL)三次，計(jì)算測(cè)定均值與配套校準(zhǔn)品標(biāo)示值的相對(duì)偏倚。

1.3.3 抗干擾實(shí)驗(yàn) 參考EP7-A2文件進(jìn)行確認(rèn)，選擇低高值1,5-AG新鮮血清樣品作為基礎(chǔ)樣本。干擾物試劑盒和空白對(duì)照由北京九強(qiáng)公司提供，以添加不同濃度干擾物之后的血清1,5-AG測(cè)定均值超過(guò)同一濃度下空白對(duì)照管的±5%為產(chǎn)生干擾作用。

1.3.4 分析測(cè)量范圍(AMR)實(shí)驗(yàn) 即線性范圍，參考EP6-A文件，分別收集血清1,5-AG濃度接近廠家聲明的分析測(cè)量范圍下限和上限的低值樣本(L)和高值樣本(H)，將L和H樣本按：7L、6L+1H、5L+2H、4L+3H、3L+4H、2L+5H、1L+6H、7H混合，配置成1,5-AG系列濃度血清，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量?jī)纱危谝粋€(gè)分析批次內(nèi)完成。

1.3.5 臨床可報(bào)告范圍(CRR)實(shí)驗(yàn) 選擇分析范圍內(nèi)高濃度標(biāo)本3份，配套稀釋液做2、4、8、16、32倍稀釋?zhuān)?jì)算稀釋回收率，確定可靠測(cè)量低限及最大稀釋倍數(shù)，以回收率(100±10)%為可接受范圍；CRR上限=AMR上限×最大稀釋倍數(shù)。

1.3.6 生物參考區(qū)間驗(yàn)證 參考C28-A2文件，對(duì)20個(gè)參考個(gè)體測(cè)定血清1,5-AG濃度，與廠家給定的參考區(qū)間比較(>14μg/mL)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料應(yīng)用Microsoft Excel 2003及SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。精密度、正確度和抗干擾分析采用x-、SD和CV表示；分析測(cè)量和臨床可報(bào)告范圍的評(píng)價(jià)應(yīng)用多項(xiàng)式回歸分析；生物參考區(qū)間驗(yàn)證應(yīng)用“1/3”規(guī)則進(jìn)行離群值檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度 吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG的批內(nèi)精密度為1.58和0.76%，批間精密度為3.37%和1.22%，見(jiàn)表1。

2.2 正確度 另一個(gè)批號(hào)校準(zhǔn)品測(cè)定均值分別是7.1μg/mL和25.32μg/mL，與配套校準(zhǔn)品標(biāo)示值相對(duì)偏倚分別為1.42%和1.27%。

2.3 抗干擾評(píng)價(jià) 低值和高值血清1,5-AG濃度基礎(chǔ)樣本重復(fù)10次測(cè)定，均值為7.1μg/mL和25.2μg/mL。當(dāng)TG≤500 mg/dL、Bil≤50 mg/dL、Hb≤20 mg/dL、VitC≤50 mg/dL時(shí)，吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG基本無(wú)干擾，見(jiàn)表2。

表2 吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG干擾評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4 AMR評(píng)價(jià) 8個(gè)系類(lèi)濃度血清1,5-AG樣本的重復(fù)測(cè)量結(jié)果的均值分別為49.82μg/mL、42.99μg/mL、35.99μg/mL、28.86μg/mL、21.71μg/mL、14.75μg/mL、7.23μg/mL、0.16μg/mL，重復(fù)測(cè)量誤差變異系數(shù)<2.0%，小于設(shè)定的允許誤差目標(biāo)5%。以理論值為X軸，測(cè)定均值為Y軸，進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。二次多項(xiàng)回歸式中非線性系數(shù)b2(-3.391)具有顯著性，三次回歸中的非線性系數(shù)b2(0.090)、b3(-0.660)均不具顯著性，二次多項(xiàng)式有較小的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤，所以最合適多項(xiàng)式為二次，最佳擬合方程為二元一次多項(xiàng)式，則認(rèn)為存在線性關(guān)系。本項(xiàng)目在0.16~49.82μg/mL的線性范圍內(nèi)，為臨床可接受線性范圍。

表3 吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果

2.5 CRR評(píng)價(jià) 標(biāo)本經(jīng)2~32倍稀釋后，確定樣本最大稀釋倍數(shù)是32倍及確定稀釋后的可靠低限是0.35μg/mL。回收率均落在90%~110%的最大稀釋倍數(shù)值，故其可報(bào)告的臨床范圍為0.35~1 594.24μg/mL，可以滿足臨床的需求，見(jiàn)表4。

表4 吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG稀釋回收率測(cè)定結(jié)果

2.6 生物參考區(qū)間驗(yàn)證 20名健康個(gè)體血清1,5-AG濃度除了一個(gè)檢測(cè)值(12.68μg/mL)低于商家提供的參考區(qū)間外，其余均在廠家提供的參考區(qū)間內(nèi)。

3 討論

血清1,5-AG作為一個(gè)新的糖尿病診斷指標(biāo)，其刷查糖尿病的臨床價(jià)值初露端倪，適于臨床推廣。1,5-AG測(cè)定方法有很多種，如質(zhì)譜分析法、高效液相色譜法、微柱層析法等，這些方法雖然較靈敏，但是操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、設(shè)備要求高。吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG可在生化分析儀上實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化操作，微量簡(jiǎn)單快速，符合臨床檢測(cè)的要求[4，9]。實(shí)驗(yàn)室在使用新的儀器設(shè)備或檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)對(duì)其方法學(xué)主要性能參數(shù)進(jìn)行初步評(píng)估。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室具體實(shí)際，本研究評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)常用生化分析儀德國(guó)西門(mén)子ADVIA2400采用吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG的主要分析性能。

本研究參照EP5-A2文件，驗(yàn)證廠商聲明的精密度性能。結(jié)果顯示批內(nèi)和批間的精密度均低于廠商的聲明和基于生物學(xué)變異的精密度質(zhì)量規(guī)范，說(shuō)明吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定，能夠滿足臨床檢測(cè)的要求。正確度驗(yàn)證采用北京九強(qiáng)公司提供另一個(gè)批號(hào)校準(zhǔn)物，其校準(zhǔn)物具有可靠的溯源性，結(jié)果顯示相對(duì)偏倚分別為1.42%和1.27%，均小于基于生物學(xué)變異設(shè)定質(zhì)量規(guī)范中的允許誤差，正確度性能得到驗(yàn)證，說(shuō)明吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG正確度高可滿足質(zhì)量要求。抗干擾評(píng)估顯示吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG具有良好的抗脂血、黃疸和溶血等干擾能力。AMR驗(yàn)證對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，則認(rèn)為血清1,5-AG濃度在0.16~49.82μg/mL范圍內(nèi)存在線性關(guān)系，該范圍在廠家提供的范圍內(nèi)并且涵蓋了臨床醫(yī)學(xué)決定水平。CRR范圍為0.35~1 594.24μg/mL，最大稀釋倍數(shù)為32倍，能夠滿足臨床的要求。廠家提供的參考區(qū)間得到驗(yàn)證，說(shuō)明該范圍有效，適合本實(shí)驗(yàn)室所在地區(qū)。

綜上所述，吡喃糖氧化酶法檢測(cè)血清1,5-AG的各項(xiàng)性能均符合臨床檢測(cè)要求。目前1,5-AG在國(guó)內(nèi)外未有標(biāo)準(zhǔn)參考方法和參考物質(zhì)可供選擇，其檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量評(píng)價(jià)沒(méi)有建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各生產(chǎn)廠商試劑盒的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)各異，實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果差異仍將存在。1,5-AG的檢測(cè)仍有其局限性和諸多方面需要更多的研究。1,5-AG作為近年來(lái)開(kāi)始在臨床逐步推廣應(yīng)用的新項(xiàng)目，本室將繼續(xù)參考相關(guān)評(píng)價(jià)文件進(jìn)行后續(xù)方法學(xué)和臨床應(yīng)用的研究，為實(shí)現(xiàn)1,5-AG標(biāo)準(zhǔn)化和一致性提供必要的基礎(chǔ)。