HLA-DQB0502HLA-A0303位點多態性與IVF-ET患者妊娠率的相關性

劉瀏，張若鵬，王惠瑩，羅加歡，周寧，張媛媛

1.大理大學臨床醫學院，云南 大理 671000；

2.大理大學第一附屬醫院生殖醫學科，云南 大理 671000；

3.大理大學生殖醫學研究所，云南 大理 671000

隨著現代社會壓力與日劇增和環境污染的加重，一定程度上影響了人類的身體健康，且伴隨著國家二胎政策的開放，準備生育二胎的家庭增多，而高齡產婦生育力存在著一定程度的下降，導致不孕癥發病率逐年上升，目前該病已成為嚴重影響我國居民生活質量的第三大疾病[1]。而針對不孕癥主要是病因治療，在治療不理想的情況下，則行輔助生殖技術(assisted repruductive technology，ART)，以體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)應用較為廣泛，但其影響因素眾多[2-3]，常常難以獲得令人滿意的結果。而目前針對IVF-ET患者妊娠率與SNP位點多態性的相關性研究并不十分明確，因此，本研究探討SNP位點與IVF-ET患者妊娠率的關聯，以期能夠為IVF-ET患者早期診斷及相關干預提供一定的依據，從而服務于臨床，造福于廣大不孕不育患者。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取于2017年12月至2018年5月在大理大學第一附屬醫院生殖醫學科行IVF-ET且符合以下納入和排除標準的不孕癥患者330例，根據術后是否妊娠分為妊娠組120例和未妊娠組210例。納入標準：①年齡25~35周歲；②無吸煙史；③無雙側卵巢手術史；④卵巢功能正常；⑤宮腔正常；⑥雙方染色體檢查正常；⑦無傳染性疾病。排除標準：①卵巢功能異常；②內分泌異常；③解剖異常；④男性精液異常；⑤生殖道感染。妊娠組平均年齡(31.30±3.58)歲，未妊娠組平均年齡(31.28±3.43)歲，兩組患者年齡比較差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因位點多態性檢測 采集兩組患者EDTA-K2抗凝血標本4 mL，若未及時檢測，將標本凍存于-20℃冰箱中待檢。檢測時，將標本從冰箱取出，冰上解凍。采用Maglso Swab DNA Isolation Kit試劑盒、oKtopure自動化核酸提取儀對樣本核酸進行提取，所有操作嚴格按照說明書進行。根據基因上的SNP位點序列的分析結果設計特異性引物，然后采用競爭性等位基因特異性PCR(KASP)法對所選基因進行檢測。每孔PCR反應體系為2×KASPV4.0 MasterMix 0.8μL、72×KASPassaymix 0.022μL、DNA template 0.8μL，根據要檢測的樣本數和檢測的SNP位點，配置相應的MasterMix和assaymix混勻，轉到96孔板中，運用LGC的IntelliQube儀器，將混合Mix和DNA模板依次加入384孔的PCR板小孔中，將PCR板進行密封。啟動儀器進行PCR擴增反應。最后通過IntelliQube儀器對PCR擴增產物進行熒光掃描，讀取熒光信號，通過散點圖獲得基因分型結果。

1.2.2 IVF-ET方法及妊娠判定 采用標準長方案進行控制性超促排卵，卵泡成熟時，在超聲引導下行卵泡穿刺取卵，在取卵當日，采用二層密度梯度離心法處理男方所取精液，行體外受精，18 h后將正常受精卵繼續進行體外培養，第三天行胚胎移植，所剩胚胎依情況凍存或是繼續囊胚培養，移植后繼續予以黃體酮支持療法。子宮內膜分型如下：A型內膜：常見于內膜增生早期，典型三線型或多層子宮內膜，外層和中央為強回聲線，外層與宮腔中線之間為低回聲區或暗區，內膜厚度為4~9 mm。B型內膜：常見于內膜增生晚期，均一的中等強度回聲型，宮腔強回聲中線斷續不清，內膜厚度9~12 mm。C型內膜：常見于黃體期，均質強回聲，無宮腔中線回聲，厚度10~14 mm。移植后第14天采血測血清HCG>5 U/L，或晨尿尿HCG檢測為陽性，診斷為生化妊娠，繼續采用黃體支持療法，6周后，超聲檢測到胎心活動或者孕囊為妊娠成功，未檢測到胎心活動或者孕囊為妊娠失敗，即未妊娠。

1.3 統計學方法 應用SPSS21.0軟件對所有數據進行分析，對所選基因進行Hardy-Weinbrg平衡檢驗，以保證所選樣本的隨機性，等位基因頻率計算：基因頻率=每組某等位基因數/該組兩等位基因數之和，計量資料以均數±標準差±s))表示，兩兩比較采用t檢驗，計數資料行χ2檢驗，并對各基因型行風險分析，計算其優勢比(odds ratio，OR)，衡量研究因素與IVF-ET患者妊娠率的關聯強度，當OR>1時，所研究基因型為妊娠成功的保護因素，當OR<1時，所研究基因型為妊娠成功的危險因素，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的移植胚胎類型和移植胚胎數比較 兩組患者的移植胚胎類型和移植胚胎數比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的移植胚胎類型和移植胚胎數量比較(例)

2.2 兩組患者的子宮內膜分型和子宮內膜厚度比較 妊娠組A、B、C型子宮內膜分別為36例、48例、36例，未妊娠組子宮內膜分型分別為62例、85例、63例，兩組子宮內膜分型比較差異無統計學意義(χ2=0.01，P=0.99)；妊娠組子宮內膜厚度為(11.00±1.91)mm，未妊娠組為(10.49±2.09)mm，差異無統計學意義(t=0.98，P=0.33)。

2.3 兩組患者各基因型的表達率比較 在本次檢測的4個SNP位點當中，經Hardy-Weinbrg平衡檢驗，rs6906021不符合遺傳平衡(χ2=8.58，P=0.01)。rs2300825(χ2=3.69，P=0.16)、rs2524005(χ2=4.66，P=0.10)、rs2855591(χ2=4.84，P=0.09)均符合遺傳平衡。rs2524005(C/T)、rs2855591(C/T)各基因型表達率在兩組患者中差異無統計學意義(P>0.05)。rs2300825(A/G)各基因型表達率差異具有統計學意義(P<0.05)。妊娠組rs2300825多態性位點A等位基因頻率為87.1%，未妊娠組為80.0%，妊娠組顯著高于未妊娠組，差異具有統計學意義(P<0.05)，且經OR值分析發現rs2300825(A/G)、rs2300825(A/A)相比于rs2300825(G/G)可提高IVF-ET患者的臨床妊娠率，OR值分別為1.526、2.769，見表2~表4，部分基因位點分型散點圖見圖1。

表2 兩組患者各基因型的表達情況比較(例)

表3 rs2300825(A/G)等位基因頻率比較[例(%)]

表4 rs2300825位點各基因型OR值分析(例)

圖1 部分樣本基因分型散點圖

3 討論

分別對符合WHO診斷標準的兩組不孕癥患者行IVF-ET[4]，兩組患者的年齡、移植胚胎類型、移植胚胎數、子宮內膜分型、子宮內膜厚度相比差異不具有統計學意義，具有可比性，且以上因素對臨床妊娠率沒有影響。

隨著近年來不孕不育發病率逐漸升高，IVF-ET應用逐步普及，但目前我國行體外受精-胚胎移植首次的成功率僅有30%左右[5]，且即使妊娠成功，也有眾多因素影響患者成功誕下胎兒[6]。HLA與人體免疫功能、免疫狀態及自身免疫易感性密切相關[7-8]，人體受孕本就是一個免疫過程，胚胎相對于母體是一種半同體抗原，研究表明多種不良妊娠情況都與HLA多態性相關[9-10]。HLA是人類主要組織相容性復合體的產物，位于第6號染色體短臂上，HLA分為HLA-I和HLA-II，其中，Ⅰ類由HLA-A、B、C位點編碼，Ⅱ類抗原受控于HLA-D區(包含5個亞區：DP,DM,DO,DQ和DR)。本次研究中所篩選的4個SNP位點中，rs2524005、rs2855591位于HLA-A*0303區，rs6906021、rs2300825位于HLA-DQB*0502區。其中，rs2300825、rs2524005、rs2855591符合Hardy-Weinbrg平衡，表明本次研究所納入的群體具有較強的代表性。兩組患者中，rs2300825各基因型表達率差異具有統計學意義(P<0.05)，經等位基因頻率分析，妊娠組A等位基因頻率為87.1%，未妊娠組A等位基因頻率為80.0%，妊娠組A等位基因頻率略高于未妊娠組，差異具有統計學意義(P<0.05)，通過對rs2300825位點各基因型OR值分析得出，rs2300825(A/G)、rs2300825(A/A)相比于rs2300825(G/G)可提高IVF-ET患者的臨床妊娠率，OR值分別為1.526、2.769。因此，本研究結果提示rs2300825位點多態性與IVF-ET患者臨床妊娠率存在一定的相關性，A等位基因的高表達可能為妊娠成功的保護因素。

HLA-DQ是體內重要的抗原提呈分子，而針對于IVF-ET患者，所移植胚胎在宮腔內種植成功是影響IVF-ET妊娠成功的一個重要因素，因此，推測HLA-DQ在這一過程中扮演著重要的作用，調控某些重要環節，在免疫性不孕不育中，其重要性已得到認可[11-12]。夫妻雙方HLA-DQ分子相容性在多方面廣為探討，如淋巴細胞免疫治療復發性流產效果、胚胎種植等方面，不同學者持不同觀點。有學者認為夫妻HLA的相容性增加，更易形成純合型胚胎妊娠，使母體的免疫調節失衡從而導致種植失敗，這種情況下一般采取供者淋巴細胞主動免疫療法，療效較好[13]，但也有學者認為，HLA-DQA1/DQB1組織相容性增高對封閉抗體的產生無影響[14]。有學者通過研究反復種植失敗患者與正常對照組相容性對比分析中，發現夫妻雙方HLA-DQ相容性與胚胎種植成功與否無顯著關聯[15]。該學者同時認為，HLA-DQB1*03可能是一個導致IVF-ET患者反復種植失敗的易感基因，而HLA-DQB1*05:02可能是一個保護性基因，這與本研究部分結果一致。

綜上所述，HLA分子特定基因型的表達率影響著IVF-ET患者的臨床妊娠率，其中，rs2300825 A等位基因的高表達為IVF-ET患者妊娠成功的保護因素，而rs2524005、rs2855591在本次研究中兩組患者之間分布無明顯區別，可能原因是本次研究中所納入樣本量較少而使分析結果呈陰性，仍需大量臨床數據佐證，同時，日后可進一步研究夫妻雙方HLA分子相容性對IVF-ET的影響。本次研究提示HLA基因多態性影響著臨床妊娠率，但其相關機制如何及是否可以進行干預仍有待進一步的研究，這些研究結果將會對IVF-ET患者有所助益，從而提高IVF-ET患者妊娠率并進一步改善妊娠結局，具有一定的臨床意義和社會學意義。