10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋DNA質量分析

房愛菊，張曉瑩，管冰心，戴宗燕，周成軍

福爾馬林固定石蠟包埋組織是病理學研究中的重要資源。近年來，隨著分子病理學技術的突飛猛進，如腫瘤相關基因的突變、靶向藥物的分子檢測等使得病理學科進入分子病理時代。腫瘤相關基因研究在現代腫瘤分子生物學研究中也越來越廣泛，因此提取的DNA質量將直接影響實驗的結果。長時間保存的石蠟組織提取的DNA質量能否滿足分子生物學的需要，成為許多研究的焦點。我們通過比較儲存10年以內的石蠟包埋組織提取的DNA濃度、純度及片段長度，探討經10%中性緩沖福爾馬林固定的石蠟包埋組織DNA質量隨著儲存時間的延長產生的變化，從而為分子生物學實驗對石蠟包埋組織的要求提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取44例淋巴結活檢石蠟包埋組織(常溫儲存，2009年—2017年每年4例，2018年取3個月內標本及半年標本各4例)均來自山東大學第二附屬醫院病理科，采用10%中性緩沖福爾馬林(購自濟南百博生物技術股份有限公司)固定6～24 h后脫水包埋制成蠟塊，蠟塊組織直徑均大于0.8 cm。常規消毒所用物品，8 μm厚連續切片5片放入1.5 mL離心管中備用。

1.2 儀器與試劑 低溫高速離心機(德國艾本德公司，型號：Eppendorf 5810)，紫外分光光度計(北京美林恒通儀器有限公司，型號：SMA4000)，3500-DX測序儀(美國ABI公司)；DNA提取試劑盒(德國凱杰公司，QIAamp DNA FFPE Tissue)、淋巴瘤基因重排試劑盒(美國Invivoscribe公司，IdentiCloneTM系列)。

1.3 DNA提取 石蠟組織先經二甲苯脫蠟(1.5 mL二甲苯，14 000 r/min離心5 min)2次，無水乙醇去除二甲苯(1.5 mL無水乙醇，14 000 r/min離心5 min)2次，晾干后備用。按試劑盒說明操作，提取蠟塊組織DNA。

1.4 DNA質量檢測

1.4.1 DNA濃度和純度檢測 按照微量分光光度計操作說明書操作，打開微量分光光度計，設置檢測雙鏈DNA的程序，吸取1 μL待測DNA進行檢測，依次讀取A260、A260/A280及雙鏈DNA的濃度值。

1.4.2 DNA片段長度(完整性)分析 用淋巴瘤基因重排試劑盒中DNA片段長度分析試劑(標本內參分子量標準定位于管家基因的引物mix,Specimen Control Size ladder，SL，貨號2-096-0021)，通過對人類細胞的管家基因(TBXAS1、RAG1、PLZF、AF4)設計不同熒光標記的引物,可以進行100、200、300、400、600 bp長度的DNA片段擴增。按照試劑盒說明書配置PCR反應體系及編輯擴增程序，以試劑盒中陰性質控品(貨號4-092-0010)做陽性對照，以去離子水做陰性對照。編輯樣本運行ABI 3500DX毛細血管電泳程序,如果能看見400、600 bp的片段，說明DNA質量完整(因為PCR會優先擴增小片段，600 bp片段會很弱或將完全看不到)，如果只出現100、200或300 bp的片段，說明DNA發生不同程度降解。

1.5 統計學處理 選用SPSS 21.0軟件，兩組樣本間均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 DNA濃度檢測結果 對44個樣本進行檢測，濃度在70.60～483.60 ng/μL，平均濃度290.13 ng/μL，樣本濃度均達到檢測要求，DNA濃度無明顯差異(P=0.264)。

2.2 DNA純度結果 44個樣本A260/A280均在1.8～2.0之間，所提取的樣本DNA未受到蛋白質或者酚類物質的污染，純度較好，樣本均符合檢測要求(表1)。

表1 樣本DNA A260/A280、濃度檢測結果

2.3 DNA片段分析 所有樣本均能擴增出100 bp的片段，各標本之間差異不大。43例樣本擴增出200 bp的片段，37例樣本擴增出300 bp的片段；11例樣本擴增出400 bp的片段，均為2014年之后的標本；7例樣本擴增出600 bp的片段，均為2018年的標本。隨著儲存時間的減少，長片段的擴增效率逐年增高(圖1)。

A：2009年標本；B：2013年標本；C：2014年標本；D：2018年5月標本；E：2018年8月標本

3 討 論

福爾馬林固定石蠟包埋組織的使用歷史已逾百年，其制備、保存和使用方法已經比較成熟。近十年來，由于分子病理檢測項目逐步開展，核酸提取和檢測技術拓展了福爾馬林固定石蠟包埋組織的應用范圍[1-2]。然而，福爾馬林固定石蠟包埋組織也存在一定的弊端，福爾馬林固定液的主要成分甲醛是最小的含氧有機物，具有較高的反應活性，可以和帶有-OH(羥基)、-SH(巰基)、-NH2(氨基)基團的分子發生親核加成反應，最終作為亞甲基(-CH2-)的提供者，與上述基團中的兩個基團反應，使自由的分子鏈被交聯起來，從而發揮對組織固定的作用，同時也對DNA分子產生不利的影響，導致DNA鏈的脆性增加，在受到剪切力作用時，更容易發生隨機斷裂[3]；同時DNA與蛋白質之間經廣泛交聯后形成牢固的復合物，可阻礙蛋白酶對組織的消化。甲醛除本身可造成DNA分子損傷外，其與氧化性物質接觸后形成的甲酸，可改變環境pH，從而影響DNA分子穩定性，使核酸中嘌呤基的β糖苷鍵容易發生水解而導致DNA鏈斷裂[4]。Funabashi等[5]提出緩沖甲醛固定標本的DNA質量好于普通甲醛固定者。我國之前的研究證實蠟塊組織中DNA在最初幾年降解迅速[6]，存放3年的標本即不能擴增出400 bp長度的片段，而對于中性緩沖福爾馬林固定的組織的DNA質量缺乏相關數據，因此我們對10年以內的標本更換標準中性緩沖福爾馬林溶液商用試劑，并標準固定時間(所有標本固定時間均控制在6～24 h內)的石蠟包埋組織DNA質量進行回顧性分析。

對DNA標本濃度及純度的評價方法，我們選用的是紫外分光光度計測定法，即利用核酸的紫外吸收性質測定核酸的質量。本研究顯示，存放10年以內的福爾馬林固定石蠟包埋組織中提取的DNA濃度及純度無顯明差異，DNA濃度雖因標本大小有所差異，但差異無統計學意義；提取的DNA A260/A280均在1.8～2.0范圍內，說明DNA中無蛋白質、酚類等污染；同時也表明DNA的濃度及A260/A280不是評價DNA質量的良好指標，無法對DNA的特征進行全面評價。

在對DNA片段長度分析中，我們使用多重PCR評價DNA的完整性，該方法被多次報道用于DNA完整性評價，該評價方法比僅通過瓊脂糖電泳來估計DNA樣本中主要片段的長度更客觀、準確且直觀[7]。我們通過實驗發現近3個月內的石蠟包埋組織中提取的DNA片段長度可達到600 bp，而半年時間降解到400 bp左右，以后降解速度變慢，5年之內的蠟塊提取的DNA均能擴增出300 bp的片段。目前基因檢測設計引物一般要求擴增長度為200～300 bp，能夠滿足目前存在的所有基因檢測平臺(包括Sanger測序、新一代測序及實時定量PCR)實驗要求。目前已有研究證實存放3年的石蠟組織標本對EGFR基因的Sanger測序檢測及AMRS法檢測均沒有影響[8-9]。隨著檢測的敏感性和特異性的提高，新一代測序技術對DNA片段的長度要求降低，一些研究也已經證實存放2～4年的石蠟組織標本提取的DNA質量能夠滿足靶向二代測序技術的要求[10-11]。本研究證實存放5年以上的蠟塊只能擴增出很少的300 bp的片段，存放10年的蠟塊僅能擴增出100 bp的片段，已經無法滿足各基因平臺檢測的需求。

綜上所述通過采用標準10%中性緩沖福爾馬林固定，固定時間控制在6～24 h內，石蠟包埋組織存放5年之內，提取的DNA質量能夠滿足目前進行分子病理檢測的大多數平臺，因此在臨床病理工作中做好固定液的選擇、控制好固定時間是保證石蠟包埋組織DNA質量的關鍵。