玻璃化法凍存組織樣本的研究進展

彭宏威，張姍姍，周宗寧，陳 文，許紫琳，陳 杭，鄒 聰，李 剛，胡 瑩，錢開宇

生物樣本尤其是組織樣本在研究各類疾病中起著重要作用，隨著精準醫學的發展，組織樣本的重要性更加凸顯。為此，生物樣本庫的建設獲得空前重視，組織樣本低溫凍存技術成為研究熱點[1]。離體后的組織經過凍存后，其組織細胞能否依然保持良好的活性及功能，這對疾病的基礎、臨床和轉化醫學研究均具有重要的意義[2]。目前，組織的凍存主要有程序化法和玻璃化法2種方法。程序化法凍存存在耗時長、產生胞內冰晶和依賴儀器設備等明顯的缺點；玻璃化法可以有效地避免冰晶的形成且操作簡單，同時具有更佳的凍存效果，成為近年來凍存研究的熱點[3]。

玻璃化法凍存是Rall和Fahy[4]在1985年首次使用的，他們采用混合多元保護劑的玻璃化溶液成功凍存了小鼠胚胎，此后這種方法被廣泛應用到多種生物樣本的凍存中[5]。由于組織由多種細胞構成，影響其玻璃化法凍存效果的因素更多，目前尚未形成統一規范的方法。作者對玻璃化法凍存原理、致細胞損傷機制、玻璃化法凍存效果的影響因素及其評價指標等進行綜述，以期為玻璃化法凍存組織樣本的標準化及后續研究提供參考。

1 玻璃化法凍存原理

玻璃化法凍存是組織在凍存過程中細胞內外的溶液直接變成介于液態和固態之間的“玻璃態”而得名的，它是利用高濃度滲透性的凍存液先置換出細胞內的自由水，再以極高的降溫速率讓組織迅速通過相變溫度區，使胞內冰晶不能形成，從而避免了細胞損傷[6]。凍存液玻璃化的形成是本方法的關鍵，合適的降溫速率和溶液濃度有助于細胞內溶液玻璃化的形成。由于溶液濃度越低，其形成玻璃化所需要的降溫速率越高，但越高的降溫速率越難實現，這就需要通過提高凍存液濃度來降低實現玻璃化所需要的降溫速率。然而，過高的溶液濃度對細胞具有一定的毒性作用，因此，溶液濃度不宜太高，與降溫速率相匹配即可[7]。據報道，凍存液濃度在40%～60%(w/w)時，較慢的降溫速率便可使溶液實現玻璃化[8]。

2 玻璃化法凍存致細胞損傷機制

組織樣本在冷凍降溫過程中引起細胞損傷的原因有很多，目前國內外研究者公認的原因為“胞內冰晶”和“溶質損傷”[9]。胞內冰晶是指快速降溫時，細胞內水分未來得及滲透到細胞外就形成了冰晶，胞內冰晶會損傷細胞器，造成細胞結構破壞[10]，從而引起細胞的致命損傷；溶質損傷是指慢速降溫時，細胞外的溶液先形成冰晶，此時細胞內外形成溶液滲透壓差，細胞內水分外滲到細胞外，細胞內溶質濃度升高，細胞器及細胞內容物長時間處于高滲溶液中而引起的細胞損傷[11]。

3 玻璃化法凍存影響組織凍存的因素

玻璃化法凍存的組織前處理、低溫冷凍和復溫等基本步驟中均存在影響凍存效果的因素，眾多研究者對組織塊大小、凍存液的選擇、凍存載體選用和復溫方式等主要因素(表1)進行了研究。

3.1 組織塊大小 為了提高凍存液的滲透效率，凍存前，組織需切分成適當形狀及大小。鑒于凍存的組織復溫后往往用做移植或培養，所以凍存的組織塊越大，細胞數量越多，功能也越全，凍存意義就越大。但組織塊越大，其內外滲透程度越不均衡，凍存時容易造成局部組織損傷壞死。目前極少有組織塊大小對組織玻璃化凍存效果比較的研究報道，多數研究者將組織塊切成橫截面積為1 mm2或長度為1 mm的形態[12-14]。

3.2 凍存液 合適的凍存液在凍存組織時可增加細胞粘性，調控細胞滲透壓，同時改變水分子的空間排列，在適宜的降溫速率下可避免溶質損傷及冰晶損傷[15]。根據滲透性的不同，凍存液可分為滲透性凍存液和非滲透性凍存液2類。滲透性凍存液能穿透細胞膜，可以結合溶液中的水分子而弱化冰晶的形成；非滲透性凍存液不能穿透細胞膜，但可提高細胞外滲透壓，使細胞內水分子滲出細胞外而降低胞內冰晶的形成。由于滲透性凍存液對細胞有毒性，非滲透性凍存液會導致細胞失水而皺縮，故2者的濃度、用量均不能太高，玻璃化法中常聯合使用這2類凍存液。

表1 影響組織凍存效果的因素

注：E為EG，乙二醇；D為DMSO，二甲基亞砜；F為FBS，胎牛血清；PG為沒食子酸丙酯；Y為培養液；Z為蔗糖；ZS為蔗糖溶液

3.3 凍存載體 組織凍存時，玻璃化法凍存通常會采用一定手段來使組織獲取最佳的傳熱速率，采用凍存載體來改善組織降溫速率最為常見。王燕蓉等[16]分別采用罐口法和超速法2種方式的液氮蒸汽預冷用塑料麥管裝載好的組織，再將其投入液氮中。有文獻表明，載桿[17]、細胞網篩[18-19]和金屬網篩[20]等不同類型的凍存載體在組織降溫速率方面發揮著重要作用，其中金屬固相表面載體[21]的效果更優。

3.4 復溫方式 復溫是組織凍存時物理狀態變化的逆過程，隨著溫度逐漸接近冰點，細胞內也會有產生冰晶的趨勢[15]。為了避免復溫時胞內冰晶損傷細胞，目前常采用提高升溫速率來使組織快速通過危險溫度區域。組織細胞復溫后有毒性的滲透性凍存液會殘留，因此，復溫液多數為低濃度凍存液或不含凍存液的培養液，且復溫后要用不同濃度梯度的蔗糖溶液對組織進行多次漂洗[17-18,20]。

4 玻璃化法組織凍存效果的評價指標

玻璃化法凍存組織的效果可通過組織學形態、細胞凋亡、移植、細胞或組織培養等內容進行評價。組織學形態是評價組織凍存效果最基本的指標之一，經固定、切片及染色等過程處理后的新鮮及凍融組織，在顯微鏡或電鏡下觀察并對比其細胞比例和結構變化，例如用顯微鏡觀察凍存前后卵泡分布比例及其結構變化，用透射電鏡觀察線粒體、內質網等亞細胞結構變化，可評估低溫冷凍對卵巢組織細胞結構完整性的影響[22]。細胞凋亡是檢測組織凍融后細胞存活率的重要指標，在評價組織凍存效果中也應用廣泛。

除了形態及存活方面的變化，凍存組織的某些生物學功能也可能會發生變化。為了進一步評估凍融后組織的功能，培養(表2)和移植(表3)是使用最多的評估方法。通過細胞或組織的體外培養，可檢測其在凍融后的生長發育能力；通過移植可評估凍融后的組織是否仍具有正常生物功能。以卵巢組織的凍存為例，可直接培養卵巢組織塊[21,25]，然后測定其組織學形態或培養液中雌二醇等激素含量來評估凍存的效果，也可通過機械分離或酶解分離出單個卵泡或卵子后[23,27]，在培養液中培養一段時間后再測定培養液中的雌激素含量、細胞的活力及數目等指標來評估凍存的效果。卵巢組織的移植可分為異種移植[28]、自體原位移植[31]和自體異位移植[32]，常通過評估移植后的組織學形態、卵泡數量及活力、雌激素含量，同時結合觀察移植物的外觀及其生長情況來評估凍存效果。

表2 組織復溫后培養評估凍存效果

注：E為EG，乙二醇；D為DMSO，二甲基亞砜；F為FBS，胎牛血清；BSA為牛血清白蛋白；PROH為1,2-丙二醇；Y為培養液；Z為蔗糖；K為抗菌物質；ZS為蔗糖溶液

表3 組織復溫后移植評估凍存效果

注：E為EG，乙二醇；D為DMSO，二甲基亞砜；F為FBS，胎牛血清；BSA為牛血清白蛋白；PROH為1,2-丙二醇；PVP為聚乙烯吡咯烷酮；DPBS為磷酸鹽緩沖液；Y為培養液；Z為蔗糖；ZS為蔗糖溶液

5 存在問題及展望

玻璃化法凍存操作簡單、費用低廉且效果良好，用于組織樣本的低溫凍存具有明顯的優勢，但目前仍有許多問題有待解決。玻璃化法凍存缺乏統一的凍存方案。由于影響組織凍存效果的因素眾多，不同研究者各自的出發點不同，因此形成了多種不同的組織玻璃化凍存方案[13-14,17-18]。不僅凍存組織塊大小的選取上[17-20]沒有絕對統一的標準，不同方案的凍存液配方[23-27]、凍存載體[17-20]及復溫方式[29-34]等關鍵因素更是差別巨大。玻璃化法凍存細胞損傷機制尚有不明之處。胞內冰晶與溶質損傷雖解釋了細胞損傷的基本原因，但凍存液對細胞的毒性，凍存對細胞膜、細胞器及遺傳物質等造成的損傷機制，胞內冰晶產生的原因等問題均沒有理想的解釋。

如何提高組織凍存的效果是評估玻璃化法的最終目標。最佳的凍存方法應對凍存液配方、凍存載體及復溫等關鍵因素進行綜合考慮，盡可能降低細胞損傷。凍存液的組合配方雖然較多，但沒有指導性的方案，仍需要繼續探索。近年來，有學者嘗試新型材料的凍存載體用于組織凍存階段的降溫過程[15]，尤其是固相表面載體，取得了較好的效果，隨著新材料的發掘及技術的進步，也可能存在某種相對最佳的材質，能夠使組織獲得適宜的降溫速率。

此外，組織凍存的研究目前主要集中在卵巢組織領域，且多數是為臨床服務的。實際上，組織樣本低溫凍存的意義遠不只是在臨床上應用，在醫學研究中也同樣非常重要。因此，各類正常、癌及癌旁組織樣本的低溫凍存研究還需要更多研究者來不斷探索。隨著低溫冷凍技術的不斷發展，凍存液配方的改進，玻璃化法凍存組織樣本的方案必將會逐步規范，并在各類樣本低溫凍存領域中愈加廣泛的應用。