長鏈非編碼RNA雙特異性磷酸酶5假基因1對三陰性乳腺癌細胞生物學行為的作用

曹亞偉，桂百卉

據報道全世界每年約有450 000人死于乳腺癌[1]，其中雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長因子受體2均為陰性的乳腺癌稱為三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)，TNBC占乳腺癌的15%～20%，由于缺乏有效的靶向治療手段而成為死亡率最高的乳腺癌類型[2-5]，深入研究乳腺癌的發病機制對研制有效的治療藥物，提高癌癥治療效果意義重大。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類缺乏編碼蛋白質功能、長度超過200個核苷酸的RNA，lncRNA在細胞增殖、分化、遷移和凋亡等生物學過程中起到了重要作用，隨著近年來高通量測序的發展，越來越多的功能性lncRNAs成為腫瘤研究的熱點[6]，雙特異性磷酸酶5假基因1(dual-specificity phosphatase 5 pseudogene 1，DUSP5P1)屬于雙特異性磷酸酶5(dual-specificity phosphatase 5，DUSP5)相關假基因，由1q42染色體編碼[7]，已有相關報道lncRNA DUSP5P1在急性髓性白血病細胞和霍奇金淋巴瘤細胞中異常高表達[7-8]，并且與腫瘤的發生發展有關，然而，lncRNA DUSP5P1在TNBC的發病過程中所起的作用目前較少有研究報道。本研究在體外條件下探討lncRNA DUSP5P1對TNBC細胞生物學行為的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 正常人乳腺導管上皮細胞MCF-10A、TNBC細胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468均購自上海中科院細胞庫，Trizol、DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；Western Blot實驗所用一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗、轉染試劑、polybrane均購自美國Sigma公司，慢病毒及轉染序列設計由吉凱基因生物有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒包裝與感染 取混合包裝質粒1.5 μg，shRNA慢病毒質粒0.5 μg，Opti-MEM培養基250 μL混合室溫孵育5 min，取脂質體Lipofectamine 2000 5 μL溶于250 μL Opti-MEM培養基室溫孵育5 min，將質粒和脂質體混合后接種于HEK293T細胞中，轉染48～72 h后收集含有病毒的培養液，此病毒液可用于感染細胞株，感染24 h后，換上正常培養基加入合適濃度的嘌呤霉素篩選病毒穩定轉染的陽性細胞，篩選3代以后，收集細胞使用實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)的方法檢測敲減的效率。

1.2.2 細胞培養、慢病毒轉染及分組 將TNBC細胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468及正常人乳腺導管上皮細胞MCF-10A培養于含有2%雙抗、5%FBS的DMEM培養基中，在37℃、5% CO2細胞培養箱培養。將MDA-MB-231細胞系分為對照組(negative control，NC)、sh-vector組和sh-DUSP5P1組共3組，分別代表不感染慢病毒、感染空載質粒慢病毒和感染sh-DUSP5P1-慢病毒(lentivirus，lenti)。

1.2.3 qRT-PCR檢測 LncRNA DUSP5P1按照操作說明使用Trizol提取細胞總RNA，使用PrimeScript逆轉錄酶將2 μg模板RNA逆轉錄為cDNA。在羅氏qRT-PCR儀器中，以GAPDH為內參，量化lncRNA DUSP5P1表達水平。設計的引物如下：lncRNA DUSP5P1正向引物5′-GTGCTGAACTAGGGGAGCTG-3′，反向引物5′-AGATGGTGGGTGAACAGGAG-3′；GAPDH上游引物5′-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物5′-TTGGA GGGATCTCGCTCCT-3′，使用2-△△Ct方法計算lncRNA DUSP5P1的相對表達水平。

1.2.4 MTT細胞增殖實驗 使用NC組、sh-vector組和sh-DUSP5P1組細胞以每孔2 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL，培養3～5 d后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續孵育4 h，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩5 min使結晶物溶解，在比色儀上選擇490 nm波長測定各孔光密度(optical density,OD)值，記錄結果，以時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5 平板克隆形成實驗 取對數生長期的NC組、sh-vector組和sh-DUSP5P1組細胞，消化成單個細胞懸液，每組細胞以每皿約200個細胞的密度均勻接種于含10 mL 5% FBS DMEM培養液的皿中，置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養2～3周，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，棄去上清液，PBS清洗后，使用4%多聚甲醛固定15 min，在顯微鏡(低倍鏡)下計數大于20個細胞的克隆數。

1.2.6 Transwell實驗 Transwell在24孔板中浸泡1 h；消化細胞，經血清培養基清洗2次，計數后配成細胞懸液，每孔加入100 μL細胞懸液；下腔室中加入10%FBS培養基在37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中孵育24 h；取出Transwell用PBS清洗3遍，5%甲醛固定，PBS清洗2遍，加入0.2%結晶紫室溫染色0.5 h，用棉球拭去表面細胞，顯微鏡下觀察計數10個視野并照相，記錄，每種實驗重復5次。侵襲實驗在此基礎上取300 μL無血清培養基，加入30 μL Matrigel，混勻后加入上室各100 μL；放入37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中孵育4～5 h以形成凝膠。

1.2.7 Western Blot實驗 從單層貼壁細胞中提取總蛋白，每孔50 μg總蛋白上樣，經電泳后轉膜，5% FBS封閉1 h，分別加入E-cadherin、Vimentin、Snail、GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，再加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2 000)，孵育2 h，加入增強化學發光液發光，凝膠成像系統進行顯影，使用Image J灰度分析檢測條帶，目的蛋白和內參GAPDH灰度值比較作為蛋白的相對表達量，每種實驗重復3次。

2 結果

2.1 TNBC細胞與正常乳腺上皮細胞lncRNA DUSP5P1表達水平比較 LncRNA DUSP5P1在TNBC細胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468的相對表達水平分別為4.17±0.35，2.53±0.35，2.37±0.15，在正常人乳腺上皮細胞系MCF-10A中的相對表達水平為1.00±0.20。TNBC細胞系MDA-MB-231、4T1、MDA-MB-468中lncRNA DUSP5P1的表達水平均明顯高于正常人乳腺上皮細胞系MCF-10A(F=65.10，P<0.05)，圖1。由于MDA-MB-231中lncRNA DUSP5P1表達相較于4T1和MDA-MB-468均高，并且其表型可同時用于增殖和遷移實驗，因此我們選擇MDA-MB-231用于慢病毒轉染。

2.2 3組細胞增殖情況比較 由于siRNA-1#敲減效率最高，我們選擇于siRNA-1#用于后續實驗，3組細胞培養12、24、48、72 h時，分別測定各組細胞OD490值，與NC組和sh-vector組比較，sh-DUSP5P1組OD490值明顯下降(分別F=33.62，90.72，41.17，77.94；均P<0.05)。3組細胞培養7 d后，與NC組和sh-vector組比較，sh-DUSP5P1組克隆形成數明顯減少(F=575.1，P<0.05)。圖2。

2.3 3組細胞侵襲和遷移情況比較 選取MDA-MB-231細胞用于細胞侵襲和遷移功能實驗，在MDA-MB-231細胞中穩定敲減DUSP5P1，敲減DUSP5P1后MDA-MB-231侵襲和遷移能力明顯下降(分別F=933.30，160.20；均P<0.05),圖3。

A：敲減DUSP5P1效率比較；B：MTT實驗OD490值比較；C：克隆形成數比較與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

與NC組比較，***P<0.001

2.4 在MDA-MB-231細胞中敲減lncRNA DUSP5P1后對上皮間質轉化標志物的影響 采用Western Blot方法，在TNBC細胞株MDA-MB-231敲減DUSP5P1后檢測上皮間質轉化標志物的變化。敲減lncRNA DUSP5P1的MDA-MB-231細胞株sh-DUSP5P1組間充質標志物Vimentin和Snail低于sh-vector組和NC組(分別F=100.11，227.37；均P<0.05)，sh-DUSP5P1組上皮標志物E-cadherin高于sh-vector組和NC組(F=6.21，P<0.05)，圖4。

圖4 在MDA-MB-231細胞中敲減lncRNA DUSP5P1后對上皮間質轉化標志物的影響

3 討論

TNBC惡性程度較高容易發生遠處轉移，由于缺乏激素及人表皮生長因子受體2受體表達，TNBC對包括激素、單抗靶向治療在內的標準化臨床治療效果不佳，TNBC患者往往預后較差[9]，因此，明確TNBC的發病機制對提高TNBC治療效果顯得尤為重要。

LncRNAs是近年來腫瘤研究的熱點，近期有許多研究報道lncRNAs在TNBC中異常表達。Wang等[10]報道lncRNA RMST抑制TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲，并且可以誘導細胞的凋亡。Zuo等[11]報道lncRNA MALAT1通過調控miR-129-5p促進TNBC細胞的增殖和遷移。Wu等[12]報道Linc00152通過DNA甲基化途徑抑制乳腺癌1號基因從而促進TNBC細胞增殖及侵襲轉移。

LncRNA DUSP5P1是一種新發現的lncRNA分子，Staege等[7]報道在包括霍奇金淋巴瘤、造血腫瘤細胞系、神經母細胞瘤細胞系和尤文肉瘤細胞系中發現lncRNA DUSP5P1異常高表達，其中DUSP5與DUSP5P1相互作用可以影響霍奇金淋巴瘤細胞細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路的激活。本研究檢測了TNBC細胞與正常乳腺導管上皮細胞中DUSP5P1表達水平，發現TNBC細胞較之正常乳腺導管上皮細胞DUSP5P1表達水平均高，表明DUSP5P1可能參與了TNBC的發病，其異常高表達可能促使乳腺上皮細胞過度增殖或突變，進而發展成腫瘤。本研究對3組細胞系分別進行增殖、侵襲及遷移實驗，發現sh-DUSP5P1組增殖、侵襲及遷移能力均明顯低于對照組、sh-vector組，提示敲減lncRNA DUSP5P1后TNBC細胞系MDA-MB-231增殖、侵襲及遷移能力受到抑制，通常腫瘤細胞發生轉移，首先要在原發灶部位侵襲基底膜，然后進入血管或淋巴結，進而發生遠處轉移，其中，腫瘤細胞的上皮間質轉化在乳腺癌的研究中很受關注[13]，在上皮間質轉化過程中，上皮細胞失去極性卻獲得侵入型間充質細胞的特征，從而有利于細胞的侵襲[14]，進一步對lncRNA DUSP5P1如何影響TNBC侵襲及遷移進行機制研究，發現敲減lncRNA DUSP5P1的MDA-MB-231細胞株sh-DUSP5P1組間充質標志物Vimentin和Snail低于sh-vector組，sh-DUSP5P1組上皮標志物E-cadherin高于sh-vector組，表明lncRNA DUSP5P1可能通過上皮間質轉化過程促進TNBC細胞系MDA-MB-231細胞侵襲及轉移，是否發生轉移對TNBC患者的預后影響十分重要[15]，這與之前Zhou等[8]報道DUSP5P1的異常高表達與急性髓性白血病患者不良預后有關類似。近期有研究報道8號染色體開放閱讀框76通過結合DUSP5P1啟動子區域激活ERK信號通路進而促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移[16]，與之前Staege等[7]報道DUSP5P1在霍奇金淋巴瘤中激活ERK信號通路一致，許多研究報道癌基因通過激活ERK信號通路影響上皮間質轉化過程促進腫瘤的侵襲和轉移[17-20]，因此，我們推測DUSP5P1可能也是通過激活ERK信號通路影響上皮間質轉化過程促進TNBC的侵襲和轉移，具體機制需要進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究結果顯示lncRNA DUSP5P1在TNBC細胞中高表達，沉默DUSP5P1表達可抑制TNBC細胞系MDA-MB-231增殖、侵襲及遷移。進一步對侵襲和遷移進行機制研究發現，lncRNA DUSP5P1可能通過上皮間質轉化過程促進TNBC細胞系MDA-MB-231細胞侵襲和遷移。LncRNA DUSP5P1有望成為TNBC治療的新靶點，當然，本研究尚有一些不足，缺少體內動物實驗的研究數據，涉及lncRNA DUSP5P1與ERK信號通路的分子機制也需要進一步研究。