MiR-138在腦膠質瘤患者血清表達的生物學效應及臨床意義

袁紅剛，李三梅

腦膠質瘤是顱內惡性腫瘤中最常見的一種[1]，世界衛生組織根據惡性程度將其分為4級：Ⅰ-Ⅱ級為低級別腦膠質瘤、Ⅲ-Ⅳ級為高級別腦膠質瘤[2]，其發病機制不明，迄今仍缺乏早期準確、客觀、系統的診斷指標，患者死亡率高、存活期短。因此，進一步了解腦膠質瘤的發生發展，明確影響腦膠質瘤惡性程度的相關因子，尋找早期的診治手段顯得尤為重要。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一類內生的，長度約為18～24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，其參與腫瘤發生、發展、轉移的各個階段[3]。有報道表明血清中游離miRNA被認為是有價值的腫瘤檢測指標之一[4]。MiR-138是腫瘤中重要的調控因子，其在腦膠質瘤細胞與組織中低表達[5]，但其在腦膠質瘤患者血清中表達的變化國內外還沒有文獻報道。本研究擬通過實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)方法對腦膠質瘤患者及健康體檢者血清中miR-138的表達水平進行檢測，體外實驗分析miR-138表達變化對腦膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討miR-138在腦膠質瘤發生發展中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究所有血清標本均來源于湖北省漢川市人民醫院神經外科腦膠質瘤確診患者及健康體檢者，并按照標準流程進行樣本收集，每組各60例，其中所有腦膠質瘤患者標本采集前均未接受放化療或手術治療，健康體檢者各項檢測指標均在正常參考范圍內且體格及影像學檢查均無異常，本研究所有納入患者均已知情且獲得本院醫學倫理委員會同意。所有血清標本收集后均立即置于4℃離心機中，3 500 r/min離心10 min；分離血清后再置于4 ℃離心機中，12 000 r/min離心15 min。將最終獲得的血清置于無RNA酶的Ep管中-80 ℃保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 血清RNA的提取及qRT-PCR檢測 利用血清miRcute miRNA提取分離試劑盒(DP501，北京天根生化科技有限公司)，按照說明書中的標準操作流程分離提取血清標本中的miRNA。以miRNA為模板，通過cDNA合成試劑盒(Thermo Scientific Inc，美國)進行逆轉錄，其具體反應體系(10 μL)：2 μL總RNA，3 μL超純水，1 μL引物，充分混勻后67 ℃孵育5 min后置于冰上；加入0.5 μL逆轉錄酶，0.5 μL RNase抑制劑，1 μL dNTP以及2 μL逆轉錄緩沖液，充分混勻后按42 ℃ 50 min，80 ℃ 5 min體系進行逆轉錄。通過Maxima SYBR Green qPCR Kit試劑盒(Thermo Scientific Inc，美國)，采用qRT-PCR的方法對2組血清樣本中的miR-138的表達水平進行檢測。其反應體系(20 μL)：2 μL cDNA，6 μL超純水，10 μL SYBR Green反應緩沖液，1 μL上游引物，1 μL下游引物；反應條件如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 30 s，共40個循環。所有檢測結果均采用2-ΔΔCt的方法進行分析。反應中所使用引物序列設計如表1。

表1 miR-138以及內參U6引物序列

1.2.2 細胞培養及轉染 人腦膠質瘤細胞系U251和U87購自中國科學院細胞庫。用含10%胎牛血清(中國NCPC公司)、200 μg/mL鏈霉素(美國GIBCO公司)和200 U/mL青霉素的高糖DMEM培養基作常規培養，培養環境為5% CO2，室溫37 ℃。miR-138 mimic(AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGTT)及miR-NC均由美國Invitrogen生物公司合成。參照Lipofectamine-2000轉染試劑盒(美國Invitrogen生物公司)分別對2種腦膠質瘤細胞系轉染miR-138 mimic和miR-NC，48 h后參照實驗方法1.2.1測定細胞轉染后miR-138表達水平的變化。

1.2.3 MTT實驗檢測細胞增殖 將分別轉染miR-138 mimic及miR-NC的2種腦膠質瘤細胞接種于96孔板中(2×103/孔)，每孔200 μL，作常規培養。處理后，向第一孔中加入20 μL噻唑藍溶液，37 ℃繼續培養4 h后小心吸去上清，加入200 μL二甲基亞砜溶液，振蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀OD490nm處檢測其吸光值并做好記錄。按照上述方法，每24 h監測1次細胞增殖情況，共計5次。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 取對數生長期腦膠質瘤細胞，用含牛血清白蛋白的培養基重懸，調整細胞密度達到5×105/mL，制備細胞懸液。取細胞懸液100 μL置于Transwell小室中，并預先在下層小室中加入適量含有20%胎牛血清的細胞培養基。細胞培養24 h后，取出Transwell小室，棄去培養液，無鈣磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，甲醇固定30 min，然后用0.1%的結晶紫染液進行染色20 min，用棉簽小心擦去小室上層細胞，再次PBS液沖洗，于顯微鏡下觀察腦膠質瘤細胞遷移與侵襲。隨機選擇5個不同視野進行細胞計數(200×)，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 腦膠質瘤患者和健康體檢者血清中miR-138表達情況 通過qRT-PCR實驗檢測腦膠質瘤患者和健康體檢者血清中miR-138表達，結果顯示：血清中miR-138表達水平，與健康體檢者(4.72±0.66)比較，腦膠質瘤患者(2.35±1.07)明顯降低(t=14.60，P<0.01)，圖1。隨腦膠質瘤患者惡性程度的增加，miR-138表達量逐漸減少，且低級別腦膠質瘤與高級別腦膠質瘤患者血清miR-138表達差異比較具有統計學意義(t=15.22，P<0.05)，但低級別腦膠質瘤患者(Ⅰ與Ⅱ級)以及高級別腦膠質瘤患者(Ⅲ與Ⅳ級)之間相互差異比較無統計學意義(t低=0.13，P>0.05；t高=0.38，P>0.05)，表2。

與健康體檢者比較，***P<0.01

表2 不同惡性程度腦膠質瘤患者miR-138相對表達量

注：與低級別膠質瘤Ⅱ級比較，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；與高級別膠質瘤Ⅲ級比較，△P>0.05，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.2 血清miR-138表達對腦膠質瘤診斷價值的ROC分析 通過ROC曲線(圖2)評估血清miR-138診斷腦膠質瘤的靈敏度和特異性，結果發現：曲線下區域面積(area under curve,AUC)為0.75(95%置信區間為0.65～0.85，P=0.00)；根據約登指數確定診斷腦膠質瘤的miR-138臨界閾值即截斷值為2.19，其診斷腦膠質瘤的靈敏度為92%、特異性為52%。提示miR-138作為診斷腦膠質瘤的標志物具有較高的診斷效率。

圖2 腦膠質瘤患者血清miR-138診斷價值的ROC曲線

2.3 轉染miR-138 mimic與轉染miR-NC腦膠質瘤細胞內miR-138表達 與轉染miR-NC組比較，轉染miR-138 mimic的2種腦膠質瘤細胞miR-138表達水平明顯升高(tA=11.93，P<0.01；tB=10.53，P<0.01)。圖3。

與miR-NC組比較，***P<0.01

2.4 MiR-138高表達對腦膠質瘤細胞增殖的影響 分別將miR-138 mimic或miR-NC轉染至2種腦膠質瘤細胞后，通過MTT實驗檢測其增殖能力的改變，結果顯示：過表達miR-138將明顯抑制腦膠質瘤細胞的體外增殖能力。圖4。

圖4 MiR-138高表達對腦膠質瘤細胞增殖的影響

2.5 MiR-138高表達對腦膠質瘤細胞的侵襲、轉移能力的影響 分別將miR-138 mimic或miR-NC轉染至2種腦膠質瘤細胞后，通過Transwell實驗檢測2種腦膠質瘤細胞的遷移與侵襲能力變化。結果顯示，轉染miR-138 mimic組腦膠質瘤細胞體外遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。圖5。

與miR-NC組相比，***P<0.01

3 討論

腦膠質瘤是一種源自神經上皮的腫瘤，占顱腦腫瘤接近一半。腦膠質瘤早期癥狀不明顯，發現時大多已經侵襲至重要功能區，導致手術無法完全切除，加上對放化療效果不明顯，造成腦膠質瘤患者，尤其是惡性膠質瘤患者生存率非常低，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌，位列第三位[6]。因此，早期診斷對于腦膠質瘤的治療及預后有著非常重要的作用。

MiRNA是非編碼RNA中的成員，近年來研究發現miRNA在腫瘤的發生發展過程中發揮了重要的作用，具有極大臨床診斷價值[7]。Lu等[8]研究發現miR-573表達水平的下調將促進胃癌的發生，可作為一種腫瘤標志物應用于胃癌的早期診斷；李濤等[9]研究發現肝癌血清miRNA-200c表達變化促進肝癌的發生、發展，并與患者預后相關；miRNA-141是潛在的前列腺癌早期診斷標志物[10]；miRNA-21、miRNA-34a參與了宮頸癌的發生發展，且兩者對宮頸癌的早期診斷具有一定的預測效能等[11]。因此，對不同腫瘤特異性miRNA的檢測將有利于腫瘤的早期診斷，從而及時采取措施來改善腫瘤患者的預后。

MiR-138是近年來新發現的一類具有腫瘤調控作用的miRNA，在多種惡性腫瘤中呈現低表達[12-13]。因此，miR-138在腫瘤形成過程中通常發揮抑癌基因的作用。Stojcheva等[14]研究表明，miR-138能通過靶向抑制細胞凋亡蛋白BIM從而抑制自噬介導替莫唑胺化療對膠質瘤細胞的耐藥；王震等[5]研究表明miR-138通過下調hTERT蛋白的表達抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移，是新的膠質瘤抑癌因子。但是這些研究都集中在細胞與組織上miR-138表達的變化，作為腫瘤良好標志物檢測項目的外周血液中miRNA表達是否變化還未見報道。本研究發現腦膠質瘤患者血清miR-138呈現低表達，且隨著腦膠質瘤的惡性程度增加，血清miR-138表達量逐漸減少。原發癌組織與血清中miRNA表達水平具有一致性[15]，既然腦膠質瘤患者組織與細胞miR-138呈現低表達，那么勢必導致血清miR-138呈現同樣變化。本研究利用ROC曲線對腦膠質瘤的診斷效率進行評估，AUC為0.75，結果呈現出較好的診斷效率；通過約登指數確定最佳截斷值為2.19，其診斷腦膠質瘤的敏感性和特異性分別為92%和52%。最佳截斷值的確定，為miR-138應用于臨床腦膠質瘤的診斷提供了實驗依據。通過體外細胞實驗發現miR-138過表達抑制腦膠質瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，提示血清miR-138低表達引起腦膠質瘤產生及惡性程度增加可能是因為腫瘤細胞增殖和侵襲作用加強所引起的。

腦膠質瘤患者血清miR-138表達下調與腦膠質瘤發生及惡性程度有關，其機制可能是因為腦膠質瘤細胞增殖和侵襲作用加強。血清miR-138測定有望成為診斷腦膠質瘤的分子生物標志物及特異性治療的靶點，其作用機制還需要進一步研究。