miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎齦溝液中的表達(dá)及臨床意義*

汪 瀟，張 斌，Hesham Al-Sharani(也門)，白 雪

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科(錦州 121000)

種植體周圍炎屬于種植體常見并發(fā)癥，發(fā)生率為4%～15%，炎癥進(jìn)展迅速，可進(jìn)一步發(fā)展為種植體周袋及種植體膿腫，造成種植體松動，因此盡早預(yù)防、診斷種植體周圍炎對于提高患者預(yù)后十分重要[1]。近期發(fā)現(xiàn)在牙周疾病及牙周炎中有較多微小RNA(miRNA，miR)異常表達(dá)[2-3]，而種植體周圍炎發(fā)病機制與牙周炎相似，因此齦溝液中miR有可能成為種植體周圍炎診斷、病情監(jiān)測的生物學(xué)指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎牙周組織中miR-23a表達(dá)明顯高于正常牙周組織，提示其可能參與牙周炎的發(fā)生[4]。此外，miR-146a廣泛參與炎癥反應(yīng)，研究顯示miR-146a在牙齦炎組織中呈上調(diào)表達(dá)，提示其可能與牙周組織炎癥發(fā)生有關(guān)[5]。目前miR-23a與miR-146a在種植體牙周炎中的作用尚不明確。本研究通過對比種植體周圍炎、健康者齦溝液中miR-23a與miR-146a表達(dá)的差異，探究其與種植體周圍炎發(fā)生、病情程度的關(guān)系，試圖為種植體周圍炎診斷提供新的方向。

資料與方法

1 一般資料 選取2018年3月至2019年5月在本院口腔科治療的56例種植體周圍炎患者作為研究對象，其中男32例，女24例，年齡在28～64歲，平均年齡為(48.39±8.04)歲。另選取同期在本院體檢的47例健康者作為對照組，男25例，女22例，年齡在29～66歲，平均年齡為(49.05±8.67)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①種植體周圍炎患者經(jīng)探診后發(fā)現(xiàn)出血，或伴有化膿；②種植體周袋深度超過5 mm；③首次接受種植體或牙周相關(guān)疾病治療；④無干擾咬合等因素；⑤受試者均知情同意，并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有吸煙史；②近期服用抗生素、抗氧化劑、非甾體抗炎藥物等；③伴全身系統(tǒng)疾病者，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、糖尿病、腫瘤等；④近期服用避孕藥、妊娠期或哺乳期婦女；⑤肝腎器官嚴(yán)重受損者。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 研究方法

2.1 齦溝液收集：將受檢牙牙齦上菌斑清除，采用清水漱口后用消毒棉球擦拭，再用氣槍吹干牙面，將濾紙沿牙齒輕柔插進(jìn)牙齦溝中，遇阻力時暫停1 min，每顆牙齒均采集兩個位點，為正中頰側(cè)及正中舌側(cè)。采用游標(biāo)卡尺記錄位點浸潤長度后，將干燥部位剪去，放置在500 μl PBS緩沖液中低溫3000 r/min離心后保留上清液，于-80℃保存。

2.2 牙周臨床指標(biāo)檢測：對牙齒正中舌緣、正中唇緣厚度進(jìn)行測量并記錄，參照文獻(xiàn)[6]對菌斑指數(shù)(Plaque index，PLI)進(jìn)行評定，評分為0～3分。探針沿種植體周牙長軸方向檢測，壓力控制在0.5 N左右，記錄齦緣到牙周袋底或齦溝底距離，即探診深度(Pocket depth,PD);記錄牙周袋底到釉牙骨質(zhì)界的距離，即附著水平(Clinical attachment level，CAL)；參照文獻(xiàn)[7]對齦溝出血指數(shù)(Sulcus bleeding index，SBI)進(jìn)行評定，評分為0～5分。

2.3 實時定量PCR分析齦溝液中miR-23a、miR-146a水平：采用mirVana PARIS試劑盒(美國Ambion公司，批號AM1556)提取齦溝液上清總RNA，檢測純度及濃度后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司，批號K1622 )將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-23a上游引物為5’-GGGGATCACATTGCCAGG-3’，下游引物為5’-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’；miR-146a上游引物為5’-CACTCCAGCTGGGIGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3’,下

游引物為5’-TGGTGTCGIGGAGTCG-3’；U6上游引物為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物為5’-CGCTICACGAATTTGCGTGTCAT-3’。采用qPCR反應(yīng)試劑盒(德國 QIAGEN，批號330504)配制20 μl反應(yīng)體系：2 μl cDNA模板，10 μl SYBR Green premix，0.6 μl上游、下游引物，6.8 μl ddH2O。采用PCR儀器(美國Bio-Rad公司C1000 Touch PCR儀)進(jìn)行擴增反應(yīng)，擴增程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火45 s，共40個循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參采用2-ΔΔCT法定量分析miR-23a、miR-146a 相對表達(dá)量。

2.4 Elisa法檢測齦溝液中IL-1β、TNF-α、IL-6水平：參考IL-1β、TNF-α、IL-6試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號依次為H002、H052、H007)說明書進(jìn)行操作，設(shè)置空白孔(只加TMB溶液和終止液)和待測樣品孔。分別將100 μl樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入待測樣品孔中，封膜后室溫孵育2 h。洗板5次后拍干，加入100 μl TNF-α、IL-1β、IL-6抗體，封膜后室溫孵育1 h。樣品孔內(nèi)加入100 μl HRP標(biāo)記抗體，封膜后避光孵育20 min，添加TMB溶液100 μl，封膜后避光孵育20 min行顯色反應(yīng)，最后每孔均加入50 μl 終止反應(yīng)液,采用酶標(biāo)儀(EL10A8型全自動酶標(biāo)測量儀，BIOBASE公司)測量波長為450 nm處OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)OD值計算因子濃度。

結(jié) 果

1 兩組患者齦溝液中miR-23a、miR-146a表達(dá)比較 與對照組相比，種植體周圍炎組齦溝液中miR-23a、miR-146a表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1兩組齦溝液中miR-23a、miR-146a表達(dá)對比

2 兩組齦溝液中炎癥因子水平比較 與對照組相比，種植體周圍炎組齦溝液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 兩組牙周癥狀比較 與對照組相比，種植體周圍炎組患者PD、CAL、PLI、SBI均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2齦溝液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

4 miR-23a、miR-146a與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 miR-23a與TNF-α、IL-1β、IL-6、PD、CAL、PLI、SBI均呈正相關(guān)(r=0.326，r=0.314，r=0.307，r=0.314，r=0.284，r=0.347，r=0.369，均P<0.05)；miR-146a與TNF-α、IL-1β、IL-6、PD、CAL、PLI、SBI均呈正相關(guān)(r=0.406，r=0.479，r=0.384，r=0.336，r=0.348，r=0.502，r=0.461，均P<0.05)。見圖1、圖2。

表3兩組受試者PD、CAL、PLI、SBI比較

圖1 miR-23a與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

圖2 miR-146a與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

5 Logistic回歸分析種植體周圍炎的危險因素 將影響種植體周圍炎發(fā)生的臨床因素性別、年齡、TNF-α、IL-1β、IL-6、PD、CAL、PLI、SBI、miR-23a、miR-146a等納入Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示IL-6、PD、CAL、PLI、miR-23a、miR-146a均為影響種植體周圍炎發(fā)生的獨立危險因素，見表4。

表4Logistic分析種植體周圍炎的危險因素

6 miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎發(fā)生中的診斷價值 ROC分析顯示，miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎均具有一定的區(qū)分能力。miR-23a的AUC為0.835(95%CI：0.762～0.914)，靈敏度為73.91%，特異度為78.56%。miR-146a的AUC為0.865(95%CI：0.783～0.956)，靈敏度為78.56%，特異度為73.15%。見圖3。

圖3 血清miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎診斷的ROC曲線

討 論

miRNA是一類長度為22～25個核苷酸的非編碼RNA，能在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、分化等生命活動。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與牙周疾病的發(fā)生。例如，miR-142-3p、miR-144-5p上調(diào)和miR-218下調(diào)均與牙周炎的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]；miR-27a過表達(dá)能夠促使新骨形成和再融合，對種植體周圍炎有一定的治療作用[10]。這些研究均表明miRNA參與牙周組織炎癥的發(fā)生，因此探究miRNA表達(dá)對種植體周圍炎的診斷以及預(yù)后預(yù)測具有重要的臨床意義。

miR-23a屬于miR-23變異體之一。過往研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a可通過調(diào)控Foxp3乙酰化而誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能缺陷[11]。Hetta等發(fā)現(xiàn)，miR-21和miR-23a在非小細(xì)胞肺癌組織表達(dá)下調(diào)，可能起致癌作用，且與患者不良預(yù)后有關(guān)[12]。Yachi等發(fā)現(xiàn)，miR-23a通過HOXD10促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲[13]。miR-23a與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，在成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化中也發(fā)揮重要作用。Godfrey等發(fā)現(xiàn)miR-23a通過負(fù)向調(diào)控HOXA5、HOXA10和HOXA11蛋白表達(dá)參與骨細(xì)胞的發(fā)育和分化[14]。Zhang等發(fā)現(xiàn)miR-23a通過靶向骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號傳導(dǎo)抑制牙周間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨，進(jìn)而參與牙周炎的發(fā)生，以此推測miR-23a可能也與種植體周圍炎的發(fā)生相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，種植體周圍炎患者齦溝液中miR-23a水平均顯著升高，提示miR-23a上調(diào)可能參與種植體周圍炎的發(fā)生。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，齦溝液中miR-23a水平與齦溝液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，以及牙周臨床指標(biāo)PD、CAL、PLI、SBI均呈正相關(guān)，表明隨著種植體周圍炎炎癥反應(yīng)和病情的加重，患者miR-23a水平升高，提示miR-23a參與種植體牙周炎的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。

miR-146a屬于miR-146家族成員之一，在天然免疫及固有免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中表達(dá)顯著升高，可通過抑制Th1細(xì)胞分化達(dá)到控制慢性炎癥反應(yīng)的目的[16]。生物信息學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成骨細(xì)胞中miR-146a表達(dá)差異較顯著[17]。Zhang等發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過調(diào)節(jié)Bcl2抑制小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-e1的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[18]。Tang等發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過TRAF6/p38途徑負(fù)性調(diào)節(jié)人牙周膜成纖維細(xì)胞對牙齦卟啉單胞菌的炎癥反應(yīng)，提示miR-146a參與牙周炎的發(fā)生[19]，然而與種植體牙周炎的關(guān)系目前尚不清楚。本研究對比健康者、種植體牙周炎患者齦溝液中miR-146a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)種植體牙周炎患者齦溝液miR-146a表達(dá)明顯高于健康者，提示miR-146a可能與種植體周圍炎的發(fā)生相關(guān)。Ghotloo等發(fā)現(xiàn)，miR-146a與牙周炎疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，隨著病情程度的增加，其水平逐漸升高[20]。與此相似，本研究發(fā)現(xiàn)齦溝液中miR-146a水平與齦溝液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，以及牙周臨床指標(biāo)PD、CAL、PLI、SBI均呈顯著正相關(guān)，表明隨著種植體周圍炎炎癥反應(yīng)和病情的加重，患者miR-146a水平升高，提示miR-146a參與種植體牙周炎的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。

miRNA在種植體周圍炎齦溝液中的異常表達(dá)有可能成為種植體周圍炎診斷及治療的突破點。本研究假設(shè)miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎患者齦溝液中的失調(diào)可能對種植體周圍炎具有潛在的診斷價值。采用ROC曲線分析miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎的診斷價值發(fā)現(xiàn)，齦溝液中miR-23a、miR-146a對種植體周圍炎均具有一定的區(qū)分能力，miR-23a診斷種植體周圍炎的AUC為0.835，靈敏度為73.91%，特異度為78.56%；miR-146a的AUC為0.865，靈敏度為78.56%，特異度為73.15%。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-23a、miR-146a是影響種植體周圍炎發(fā)生的危險因素。這些結(jié)果提示，齦溝液中miR-23a、miR-146a與種植體周圍炎的發(fā)生相關(guān)，可能是種植體周圍炎潛在的診斷標(biāo)志物。

綜上所述，種植體周圍炎齦溝液中miR-23a、miR-146a表達(dá)上調(diào)與患者炎癥反應(yīng)、病情程度相關(guān)，可能為種植體周圍炎的潛在診斷標(biāo)志物，且是影響種植體周圍炎的危險因子。本研究僅評估了miR-23a、miR-146a在種植體周圍炎中的臨床意義，并未對其具體機制進(jìn)行研究，有待后續(xù)完善研究方案深入探究。