過表達miRNA-224骨髓間充質干細胞對卵巢顆粒細胞增殖和氧化應激的影響*

蔣 來，陳 玲，彭 影，公顏平，張秀云

中國科學技術大學附屬第一醫院(合肥230001)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性因卵巢功能衰竭而出現閉經的現象，多發生于40歲之前。POF是育齡期女性常見的生殖系統疾病，其臨床表現包括閉經、不孕和性欲下降等。近年來，隨著社會發展和生活節奏的加快，POF的發病率逐漸升高，且日趨低齡化，嚴重影響我國女性生殖健康[1-2]。骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是從骨髓中分離出的多功能干細胞，具有自我修復和多向分化潛能，是組織工程領域常用的種子細胞[3]。研究表明，BMSCs可通過保護原始卵泡、抑制卵巢顆粒細胞的凋亡部分改善卵巢功能，但其療效仍需進一步提高[4]。微小RNA(miRNA)廣泛存在于真核生物細胞內，是一類由18～22個核苷酸組成的非編碼RNA。miRNA在細胞的生長、發育、分化和衰老等過程發揮重要的作用。miRNA與生殖系統疾病的發生發展密切相關，其中，miRNA-224是較早在生殖系統中發現的miRNA。高冬梅等[5]發現，與正常組織相比，宮頸癌組織中miRNA-224的表達水平顯著升高，且miRNA-224可作為宮頸癌臨床診斷和評估預后的標記物。Zhang等[6]也證實，miRNA-224在卵巢中表達，且上調miRNA-224可促進卵巢顆粒細胞的增殖，抑制顆粒細胞的凋亡。但鮮有報道研究miRNA-224在卵巢早衰中的作用及其機制。本研究首先構建miRNA-224轉染的BMSCs，繼而將BMSCs與卵巢顆粒細胞共培養，觀察過表達miRNA-224的BMSCs對卵巢顆粒細胞增殖和氧化應激的影響，以期為POF的治療提供新的靶點及理論依據。

材料與方法

1 實驗材料 Wistar大鼠購自南京模式動物研究所；過表達miRNA-224慢病毒LV-miRNA-224及對照慢病毒LV-GFP由上海吉凱基因工程技術有限公司構建和鑒定；順鉑購自美國 Sigma 公司；DMEM培養基均購自美國 Gibco 公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、丙二醛(MDA)和細胞內活性氧(ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

2 BMSCs的分離、培養和轉染 將Wistar大鼠麻醉，置于無菌操作臺上，取出脛骨和股骨，用預冷的DMEM培養基沖洗骨髓腔，收集沖洗液后重懸細胞。將細胞接種于培養瓶中，置于5% CO2培養箱中，37℃條件下培養。利用貼壁法篩選出純度較高的BMSCs。待細胞貼壁且生長穩定后，胰蛋白酶消化重懸細胞，以CD34、CD44、CD45和CD105抗體標記所提取的原代BMSCs，以流式細胞術檢測原代BMSCs中CD34、CD44、CD45和CD105的表達情況，證明其為 BMSCs。隨后將提取的原代BMSCs接種于三個培養皿中，將細胞分為三組。其中空白組：未做任何處理的原代BMSCs細胞；BMSCs組：轉染LV-GFP的原代BMSCs細胞；miRNA-224+BMSCs組：轉染過表達慢病毒LV-miRNA-224的原代BMSCs細胞，并用于以下實驗。

3 qRT-PCR法檢測空白組、BMSCs組、miR-224+BMSCs組miRNA-224的表達 移除上清液，提取細胞總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，擴增后以U6作為參照物，檢測miRNA-224 mRNA的表達。miRNA-224上游引物序列為 5’- GTAGAAGTCTAACTGGAAAAC-3’，下游引物序列為5’- CATGTCATCATCAACACCACTG-3’。U6上游引物序列為 5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3’，下游引物序列為5’- TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3’。

4 卵巢顆粒細胞的分離和培養 取21～24 d雌性Wistar大鼠，皮下注射孕馬血清促性腺激素,無菌條件下將卵巢取出。注射器刺破卵巢，吸出顆粒細胞，將重懸后的細胞接種于96孔板中，37℃條件下培養。將轉染后的BMSCs與卵巢顆粒細胞共培養24 h，按200 μl/孔加入順鉑(濃度為2.5 μg/ml)。將細胞分為六組：①對照組為未做處理的BMSCs原代細胞與卵巢顆粒細胞共培養組；②BMSCs共培養組：將轉染LV-GFP的原代BMSCs細胞與顆粒細胞共培養；③miRNA-224+BMSCs共培養組：將轉染LV-miRNA-224的原代BMSCs細胞與卵巢顆粒細胞進行共培養；④順鉑組：在原代BMSCs細胞與顆粒細胞共培養的同時給予一定濃度的順鉑進行處理；⑤BMSCs+順鉑組：轉染LV-GFP的原代BMSCs細胞與顆粒細胞共培養的同時給予一定濃度的順鉑進行處理；⑥miRNA-224+BMSCs+順鉑組：轉染LV-miRNA-224的原代BMSCs細胞與卵巢顆粒細胞進行共培養的同時給予一定濃度的順鉑進行處理。

5 卵巢顆粒細胞的鑒定 應用免疫組化法鑒定卵巢顆粒細胞，具體操作步驟如下：待細胞貼壁后，加入4%多聚甲醛固定，封閉后滴加卵泡刺激素受體(FSHR)抗體，4℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗后室溫下孵育30 min，顯色后蘇木素復染，返藍后脫水封片，顯微鏡下檢查。

6 MTT法檢測細胞存活率 將處理后的細胞接種到 96 孔板，移除上清液，每孔加入5 g/L 的 MTT，孵育后移除上清液，加入二甲基亞砜溶液，孵育10 min。檢測490 nm 波長下各組細胞的吸光度值(OD值)，計算存活率，細胞存活率(%) = 處理組 OD 值/正常組 OD 值×100%。

7 氧化應激水平檢測 移除上清液后，收集活細胞，嚴格按照各試劑盒的步驟操作，檢測各組細胞總丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平。

結 果

1 miRNA-224的表達 qRT-PCR檢測結果顯示，轉染后miRNA-224表達水平顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1各組細胞miRNA-224表達水平

注：與空白組相比，*P<0.05

2 卵巢顆粒細胞的鑒定 顯微鏡下觀察可見顆粒細胞呈多角形或短梭形，胞內可見顆粒樣物質(圖1A)；此外，FSHR免疫組化檢測結果顯示，顆粒細胞呈棕色(圖1B)，陰性對照的細胞為藍紫色(圖1C)。

圖1 卵巢顆粒細胞的鑒定(免疫組化法，×100)

3 細胞存活率比較 與對照組相比，順鉑組細胞存活率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05 )；而與順鉑組相比，BMSCs+順鉑組和miRNA-224+BMSCs+順鉑組細胞存活率顯著升高，且相較于BMSCs+順鉑組，miRNA-224+BMSCs+順鉑組細胞存活率進一步升高，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組、BMSCs組和miRNA-224+BMSCs組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2MTT法檢測各組OD值和細胞存活率

注：與對照組相比，*P<0.05；與順鉑組相比，△P<0.05；與BMSCs+順鉑組相比，▲P<0.05

4 細胞氧化應激水平比較 與對照組相比，順鉑組細胞MDA和ROS水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；而與順鉑組相比，BMSCs+順鉑組和miRNA-224-BMSCs+順鉑組細胞MDA和ROS水平顯著降低，且相較于BMSCs+順鉑組，miRNA-224-BMSCs+順鉑組細胞MDA和ROS水平進一步降低，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組、BMSCs組和miRNA-224-BMSCs組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3各組細胞MDA值和ROS水平

注：與對照組相比,*P<0.05；與順鉑組相比,△P<0.05；與BMSCs+順鉑組相比,▲P<0.05

討 論

近年來，隨著女性腫瘤患者的增加和化療的廣泛開展，化療所致的POF已逐漸成為臨床和基礎研究的焦點。順鉑等化療藥物可導致卵巢組織的形態和結構發生改變，包括原始卵泡數量減少、顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖等，最終引起卵巢組織纖維化和POF[7]。臨床研究表明，育齡期乳腺癌患者接受化療后，將近55%的患者可出現POF[8]。顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，也是雌、孕激素的主要來源，在卵泡生長發育過程中起著舉足輕重的作用。研究表明,卵巢顆粒細胞的凋亡與卵泡閉鎖和POF的發生密切相關，而抑制卵巢顆粒細胞的凋亡可以避免或延緩POF的發生[9]。

BMSCs是一類具有自我修復和多向分化潛能的干細胞,在維持機體組織形態和功能的完整性方面發揮重要的作用。BMSCs在組織工程、基因治療和細胞替代治療等領域發揮重要的作用,可用于脊髓修復、心肌再生和抗衰老等。Fu等[4]的研究表明，BMSCs移植可抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，提高卵巢抗氧化功能，降低化療藥引起的卵巢損傷。Kim等[10]的研究也證實,BMSCs移植可降低化療藥物引起的卵巢顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖,改善卵巢功能。但相關研究也表明，BMSCs移植并不能完全逆轉化療藥引起的卵巢損傷，僅能部分恢復卵巢功能。其中，移植后BMSCs的快速凋亡是療效不佳的主要原因。因此，提高BMSCs的存活率顯得尤為重要[11]。

miRNA-224是較早在生殖系統中發現的miRNA,在卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡過程中發揮重要的調控作用[12]。既往文獻報道，過表達miRNA-224可促進卵巢顆粒細胞的增殖，抑制顆粒細胞的凋亡[6]。然而，尚不明確miRNA-224能否增強BMSCs對POF的療效。本研究首先構建miRNA-224轉染的BMSCs,繼而將miRNA-224-BMSCs與順鉑處理的卵巢顆粒細胞共培養。結果顯示，順鉑處理后顆粒細胞的存活率顯著降低，而與BMSCs共培養可提高顆粒細胞的存活率，且過表達miRNA-224的BMSCs可進一步提高顆粒細胞的存活率。提示過表達miRNA-224的BMSCs具有更強的抑制卵巢顆粒細胞凋亡的能力。

順鉑等化療藥物導致POF的具體機制至今仍未完全清楚，其中，氧化應激損傷被認為是最重要的機制之一[13]。MDA和ROS是細胞內重要的氧化應激指標，MDA是脂質過氧化過程中產生的醛類物質，ROS由半醌自由基與氧結合后形成，兩者均可加重順鉑的細胞毒性[14-16]。本研究結果表明，順鉑處理的顆粒細胞，其MDA和ROS水平顯著上調，而BMSCs與顆粒細胞共培養可降低MDA和ROS水平，且過表達miRNA-224的BMSCs可進一步降低MDA和ROS水平，提示miRNA-224通過降低氧化應激水平抑制順鉑誘導的卵巢顆粒細胞凋亡。

綜上所述，本研究結果表明，過表達miRNA-224的BMSCs可明顯降低順鉑誘導的卵巢顆粒細胞凋亡，其機制與氧化應激密切相關。本研究為防治POF提供了新的靶點和理論依據。然而，本研究仍有不足之處：沒有進行在體動物實驗，缺乏體內實驗數據。因此，這些不足將是我們接下來研究的重點。