黏脂貯積癥Ⅱ型的發生機制及病理癥狀研究進展

焦資君,金介員,項 榮

(中南大學生命科學學院,中國湖南 長沙 410013)

黏脂貯積癥Ⅱ型(mucolipidosis typeⅡ,MLⅡ或I-cell disease;OMIM 252500)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病,其發生率為1/125 000～1/625 000[1]。值得注意的是,在加拿大Quebec(魁北克)地區黏脂貯積癥Ⅱ型攜帶者頻率竟有1∶39之高,其新生兒發病率高達1∶6 000[2]。黏脂貯積癥Ⅱ型是由GNPTAB基因純合突變或復合雜合突變導致N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase)的功能完全喪失而引發的溶酶體儲存障礙疾病[3]。GNPTAB基因的編碼產物是N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的主要部分,大部分溶酶體酶需要在N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的作用下合成甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosophate,M6P)分選信號,M6P的作用是將各種溶酶體酶靶向運輸到溶酶體。黏脂貯積癥Ⅱ型患者細胞內的溶酶體酶因缺少M6P分選信號,導致溶酶體酶分選錯誤并大量被分泌到細胞外環境,這將對患者的細胞、組織、器官乃至系統產生廣泛的影響。

1 黏脂貯積癥Ⅱ型的表型與診斷

黏脂貯積癥Ⅱ型患者在產前和新生兒時期就會發病且大多數生命不超過10歲,嚴重者出生后幾個月就會死亡。患者出生時的身高和體重均低于正常人,在2歲后身高停止增加,最終身高小于80 cm[3]。黏脂貯積癥Ⅱ型的典型表型包括[4～5]:1)骨骼異常,比如顱縫早閉、骨質減少、佝僂病、胸廓畸形、脊柱后凸、髖關節發育不良、畸形足、軟骨發育不良、所有大關節攣縮等;2)嚴重的精神運動遲緩;3)皮膚增厚、面部粗糙、牙齦肥大;4)心臟肥大,二尖瓣功能不全;5)氣道變窄,呼吸功能不全;6)復發性肺炎;7)肝脾腫大。

GNPTAB突變可以導致黏脂貯積癥Ⅱ型或黏脂貯積癥Ⅲ α/β 型(mucolipidosis type Ⅲ α/β,MLⅢα/β,OMIM 252600)。黏脂貯積癥Ⅱ型與黏脂貯積癥Ⅲα/β型患者有許多共同的生理特征[6],如面部粗糙、身材矮小、漸進性關節僵硬、骨骼異常、心臟肥大和發育遲緩等,但黏脂貯積癥Ⅱ型比黏脂貯積癥Ⅲα/β型更嚴重,黏脂貯積癥Ⅱ型患者在嬰兒期或兒童早期就會發病且大多數生命不超過10歲。黏脂貯積癥Ⅲα/β型的發生率為1/53 000～1/1 250 000[1],表型相對溫和,臨床癥狀出現較晚,大約在3歲或者更晚出現,進展較慢,病程較長,大多可以存活到成年。黏脂貯積癥Ⅱ型與黏脂貯積癥Ⅲα/β型之所以有上述差異,主要原因是GNPTAB突變類型不同,從而使其產物N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的活性受到的影響程度也就不同。當GNPTAB發生純合或復合雜合的移碼或無義突變時,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的活性幾乎完全喪失,患者則表現出癥狀嚴重的黏脂貯積癥Ⅱ型;當GNPTAB發生錯義或剪接位點突變時,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶會保留部分活性,患者則表現出癥狀相對較輕的黏脂貯積癥Ⅲ α/β 型[7]。Wang等[6]報道,GNPTAB基因c.1090C＞T(p.R364*)的純合突變導致黏脂貯積癥Ⅱ型,而GNPTAB基因的復合雜合突變c.1090C＞T+c.2715+1G＞A(p.R364*+IVS13+1G＞A)則導致黏脂貯積癥Ⅲα/β型,后者的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶由于保留了部分活性而使疾病癥狀相對較輕。此外,極少量GNPTAB基因突變患者中會出現中間型的mucolipidosis(intermediate ML),它是介于黏脂貯積癥Ⅱ型和黏脂貯積癥Ⅲα/β型之間的一種表型。Intermediate ML的臨床癥狀為身材矮小、面部粗糙、所有關節活動受限、手短而寬等,其嚴重程度與黏脂貯積癥Ⅱ型相似或略輕,比黏脂貯積癥 Ⅲ α/β型嚴重,但該類患者的壽命遠遠高于黏脂貯積癥Ⅱ型,與黏脂貯積癥Ⅲ α/β型相似。

黏脂貯積癥Ⅱ型的診斷需從表型、酶活性及基因突變幾個方面進行綜合考慮。在黏脂貯積癥Ⅱ型患者血漿中部分溶酶體水解酶活性呈高水平狀態,如β半乳糖苷酶、α半乳糖苷酶、α葡糖苷酶、β氨基己糖苷酶、α甘露糖苷酶、β甘露糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶等,這些溶酶體水解酶活性可達到正常范圍的10～60倍甚至更高[7～8]。Wang等[6]檢測了30例黏脂貯積癥Ⅱ型患者和8例黏脂貯積癥Ⅲα/β型患者血漿α甘露糖苷酶的活性,結果顯示該酶活性都呈高水平狀態,但在兩類患者之間無顯著差異。黏脂貯積癥Ⅱ型和黏脂貯積癥Ⅲα/β型可通過臨床診斷進行區分[9],黏脂貯積癥Ⅱ型患者病癥出現早,一般幾個月或幾歲就有明顯嚴重癥狀,如嚴重發育遲緩、全身張力減退、牙齦增生、身材矮小、五官粗糙、骨骼畸形等;黏脂貯積癥Ⅲα/β型患者雖然與黏脂貯積癥Ⅱ型患者有許多相似癥狀,如身材矮小、骨骼異常、發育遲緩等,但癥狀相對溫和,且出現較晚、進展較慢、病程較長,可以存活到成年。黏多糖貯積癥(mucopolysaccharidosis)雖具有與黏脂貯積癥Ⅱ型相似的臨床特征,但二者可通過尿檢結果比較葡糖氨基葡聚糖進行區分:在黏多糖貯積癥患者中葡糖氨基葡聚糖有明顯增加,葡糖氨基葡聚糖的尿檢結果是陽性,而在黏脂貯積癥Ⅱ型患者中葡糖氨基葡聚糖的水平是正常的,葡糖氨基葡聚糖的尿檢結果是陰性[10]。另外,從GNPTAB基因測序結果看,GNPTAB基因雙等位基因致病變異將輔助黏脂貯積癥Ⅱ型患者的臨床診斷[7]。

2 黏脂貯積癥Ⅱ型的發生機制

2.1 M6P標記的形成與溶酶體酶的定向運輸

溶酶體在細胞內主要起消化作用,清除無用的生物大分子、衰老的細胞器和衰老損傷及死亡的細胞等[11]。溶酶體的功能是由其包含的多種不同酸性水解酶所完成的,這些溶酶體酶包括糖苷酶、硫酸脂酶、磷酸酶、脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等[11],大多數溶酶體酶是通過M6P分選信號靶向運輸到溶酶體行使功能[12]。

M6P標記分兩步合成[12],此過程需要兩種酶參與:N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶和磷酸葡糖苷酶。第一步,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶與被識別的溶酶體水解酶和單糖二核苷酸結合,將單糖二核苷酸上磷酸化的N-乙酰氨基葡萄糖轉移到溶酶體水解酶高甘露糖寡糖鏈上的甘露糖殘基上;第二步,磷酸葡糖苷酶除去連接在溶酶體水解酶末端的N-乙酰氨基葡萄糖,暴露出磷酸基團,從而形成M6P標記。溶酶體酶在粗面內質網上合成后經過加工、修飾形成N-連接的甘露糖蛋白,然后內質網以出芽的方式將它轉運到高爾基體,在高爾基體順面膜囊中寡糖鏈上的甘露糖殘基被磷酸化形成M6P標記,帶有M6P標記的酶與高爾基體反面膜囊上的M6P受體結合并經網格蛋白包被膜泡運輸到溶酶體中。

有M6P標記的溶酶體酶能靶向運輸到溶酶體行使正常功能,而GNPTAB基因突變導致N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶功能喪失,使溶酶體酶磷酸化和定位異常,從而不能正常形成M6P標記,最終溶酶體酶的靶向運輸受阻并引起細胞內溶酶體功能異常[13]。

2.2 GNPTAB基因突變導致黏脂貯積癥Ⅱ型

N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶是相對分子質量為540 kD的異六聚體復合物,由α、β、γ 3種不同亞基按2∶2∶2的比例組成[14]。其中,α和β亞基由GNPTAB基因編碼,γ亞基由GNPTG基因編碼。人GNPTAB基因位于染色體12q23.3,含21個外顯子[7]。GNPTAB基因經過轉錄和翻譯后在高爾基體膜上形成由1 256個氨基酸組成的無活性αβ前體蛋白,隨后S1P(site-1 protease)蛋白酶將αβ前體蛋白從第928位的賴氨酸和第929位的天冬氨酸之間斷裂,形成α、β兩部分,參與六聚體的組裝[14～15]。

GNPTAB基因編碼的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的α/β亞基包含三類可識別的結構域(Stealth、Notch和 DMAP)[16]:4個 Stealth結構域,其氨基酸位置分別位于75～86位、322～438位、955～1 020位、1 149～1 185位;兩個Notch結構域,分別位于438～468位、505～535位;1個 DMAP相互作用結構域,位于第694～819位。Stealth結構域類似于在細菌中發現的能調解細胞壁多糖合成的因子,是N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的催化功能結構域;Notch結構域屬于Notch受體家族,它們能誘導與之結合的蛋白質裂解;DMAP相互作用結構域能與水解酶結合[16]。目前已有200多個GNPTAB基因突變被報道[17]。GNPTG基因編碼的γ亞基是一個由305個氨基酸組成的可溶性糖蛋白,能增強部分溶酶體酸性水解酶底物的磷酸化作用[18]。

Qian等[16]構建了GNPTAB基因31個已知的錯義突變的點突變細胞系,這些突變位點分布在Stealth、Notch、DMAP結構域。在Stealth結構域的錯義突變分析實驗中,大部分Stealth結構域的錯義突變使N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶滯留在內質網,另有6個Stealth結構域錯義突變的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶能夠到達高爾基體,但是也沒有催化功能。這說明Stealth結構域在N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶中行使催化功能。同時,他們還證實Notch和DMAP結構域的突變并不影響N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的催化功能,但是Notch和DMAP結構域突變后N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶對其底物的選擇性識別能力卻明顯減弱。以上結果表明在N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶中α、β亞基能特異性識別底物并起催化作用。

針對N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶結構域的功能分析[16]顯示,GNPTAB基因突變將從以下幾個方面影響N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的功能:1)導致錯誤折疊,使αβ前體蛋白從內質網中輸出受阻;2)改變N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶的催化結構域,使之對單糖底物的催化活性喪失;3)降低N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶與溶酶體酸性水解酶的識別、結合,導致溶酶體酸性水解酶的甘露糖磷酸化降低。

3 黏脂貯積癥Ⅱ型的主要病理特征

3.1 骨發育異常

骨改變是黏脂貯積癥Ⅱ型的一個顯著特征,包括:骨骼生長受損,進行性骨營養不良,破壞性的骨損害導致的胸廓畸形、后凸、畸形足、長骨和髖關節脫位等。骨骼是一種高度動態的組織,通過重塑過程進行連續更新,保留其機械特性和鈣穩態。骨重塑活動由3個連續的階段組成:破骨細胞骨吸收的激活;從分解代謝轉變為合成代謝;成骨細胞修復形成新骨。有觀點認為,在黏脂貯積癥Ⅱ型中缺少M6P的溶酶體水解酶由于不能正常運輸至溶酶體中而導致骨吸收作用增強[19]。

為分析N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶功能缺失對機體骨骼變化的影響,Kollmann等[20]構建了N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶缺陷小鼠模型,結果顯示該缺陷小鼠的破骨細胞增加,同時成骨細胞活性降低;進一步的機制分析發現,在該缺陷小鼠成骨細胞中白細胞介素-6的分泌顯著增加,推測這可能是促使破骨細胞生成增加的一個因素。

水解酶的高分泌是黏脂貯積癥Ⅱ型的一個顯著特征,這些水解酶不適當的胞外作用被認為是骨骼異常的原因之一,但是,將水解酶活性與疾病表型聯系起來的機制仍然知之甚少[21]。正常情況下,組織蛋白酶K的前體通過M6P標記運輸至溶酶體中,當N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶出現缺陷時,組織蛋白酶K則會被分泌到細胞外。Flanagan-Steet等[21]發現,在黏脂貯積癥Ⅱ型患者中分泌到胞外的組織蛋白酶K可以通過干擾轉化生長因子-β信號影響骨和軟骨的發育。

3.2 肺動脈高壓

肺動脈高壓常見于黏膜多糖病和戈謝病,但在黏脂貯積癥Ⅱ型中不常見,Kovacevic等[22]第一次在黏脂貯積癥Ⅱ型患者中報道了肺動脈高壓并發癥。Recla等[23]報道了一位患有黏脂貯積癥Ⅱ型并伴有嚴重肺動脈高壓的男孩,他們發現該患者內皮素-1的水平升高,但是內皮素-1前體的水平是正常的,這表明內皮素-1的降解受損,而不是合成增加。因此他們認為,內皮素-1在溶酶體中降解受損是該患者肺動脈高壓發生的原因之一。

組織蛋白酶A能與β-半乳糖苷酶和唾液酸酶共同組成溶酶體多酶復合物,具有激活唾液酸酶并保護β-半乳糖苷酶和唾液酸酶不被快速降解的作用[24]。組織蛋白酶A基因缺陷會導致半乳糖中毒,同時半乳糖血癥患者的表型特征還包括高血壓和心肌病[25～26],這表明組織蛋白酶A可能還有其他功能。Seyrantepe等[26]發現并證實組織蛋白酶A的酶活性是內皮素-1失活的重要條件。所以,在黏脂貯積癥Ⅱ型患者中溶酶體缺乏組織蛋白酶A將導致內皮素-1在溶酶體中的降解過程受阻,這可能是引起患者心血管異常的因素之一。

3.3 精神運動發育遲緩

黏脂貯積癥Ⅱ型患者都有明顯的精神運動發育遲緩特征。Paton等[27]根據先前報道的黏脂貯積癥Ⅱ型患者的突變c.2664C＞G(p.Y888X)構建了相應突變位點的小鼠黏脂貯積癥Ⅱ型突變模型。該小鼠模型首次模擬了黏脂貯積癥Ⅱ型患者運動功能障礙和精神運動遲緩的行為特征,表現出與黏脂貯積癥Ⅱ型患者相似的表型,包括:生長發育遲緩,骨骼和面部異常,循環溶酶體酶活性增加,細胞內溶酶體貯存,壽命縮短,出現進行性神經變性病變并且浦肯野氏細胞嚴重喪失。在GNPTABc.3082insC突變的黏脂貯積癥Ⅱ型小鼠大腦中,α-L巖藻糖苷酶、β-氨基己糖苷酶、α-甘露糖苷酶和尼曼-皮克C2蛋白進入溶酶體明顯受阻,并造成神經節苷脂、膽固醇、單酰甘油磷酸鹽顯著積累[28],這些可能與黏脂貯積癥Ⅱ型患者精神運動發育遲緩有關,但其具體機制有待進一步研究。

3.4 復發性肺炎

復發性肺炎是黏脂貯積癥Ⅱ型患者常見表型之一。研究報道,1例24個月大的黏脂貯積癥Ⅱ型患者6次因肺炎住院[8],有些黏脂貯積癥Ⅱ型患者的第一癥狀就是肺炎或長期復發性肺炎[6]。Yokoi等[29]從3例散發黏脂貯積癥Ⅱ型患者血樣中分離了淋巴細胞亞群,經分析發現幾乎所有來自患者的B細胞都含有空泡樣包涵體,而CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷細胞和單核細胞無包涵體。Otomo等[30]在黏脂貯積癥Ⅱ型小鼠模型中也觀察到了相同的B細胞狀態,該小鼠脾臟B細胞存在空泡樣包涵體,而T細胞是正常的;而且,除了B細胞成熟缺陷外,該黏脂貯積癥Ⅱ型小鼠的抗原加工提呈和抗體產生都受到了影響。目前,人們在黏脂貯積癥Ⅱ型患者中也得到了類似的結果,患者B細胞和記憶B細胞數量要低于正常水平;同時,血清免疫球蛋白檢測顯示,患者的總IgG、IgA和IgM濃度與參考值相比較低;最重要的是,黏脂貯積癥Ⅱ型患者對疫苗接種的特異性抗體反應較差或無法檢測到[30]。這些資料說明黏脂貯積癥Ⅱ型患者免疫系統功能受損可能使肺部更易受到感染。

3.5 睡眠呼吸障礙

黏脂貯積癥Ⅱ型患者氣道狹窄、鼻梁下陷、脊柱后凸等異常的生理表型會影響到患者的呼吸狀況,特別是在睡眠狀態時可能會造成患者睡眠呼吸障礙[31]。睡眠呼吸障礙是黏脂貯積癥Ⅱ型患者的常見表現,但這一潛在的危險因素常常被忽視。睡眠呼吸障礙在黏脂貯積癥Ⅱ型和黏脂貯積癥Ⅲ型患者中都是存在的。目前,記錄黏脂貯積癥Ⅱ型患者睡眠呼吸障礙的客觀數據很少。Tabone等[32]揭示了5個黏脂貯積癥Ⅱ型患者的睡眠質量情況,發現所有患者均存在阻塞性睡眠呼吸暫停,他們的睡眠呼吸暫停低通氣指數的中位數是36次/小時(正常人＜2次/小時)。手術是治療嚴重阻塞性睡眠呼吸暫停的首選方法,但對于患有黏脂貯積癥Ⅱ型的阻塞性睡眠呼吸暫停患者,手術治療的效果有限且存在很大風險,而給予持續氣道正壓通氣能改善黏脂貯積癥Ⅱ型患者的睡眠呼吸狀態[32～33]。

4 黏脂貯積癥Ⅱ型的支持性治療

1986年,一位患有黏脂貯積癥Ⅱ型的日本小女孩在8個月大時接受了來自她哥哥的骨髓[34],她是首例接受骨髓移植治療的黏脂貯積癥Ⅱ型患者,治療后她的肝臟腫塊減少,精神性運動發育能達到4～8個月正常小孩水平,但其他癥狀(如心力衰竭、關節攣縮、牙齦肥厚、皮膚緊繃、身材矮小等)沒有改善,也沒有進一步惡化。此外,患者的呼吸系統有所改善,對呼吸機依賴程度下降,感染頻率較之前有所降低,但接受骨髓移植治療5年后死于肺炎和肺功能不全[35]。

針對22例進行了造血干細胞移植治療的黏脂貯積癥Ⅱ型兒童的跟蹤研究發現,最后一次隨訪的總生存率只有27%,平均死亡時間為27.6個月,值得一提的是22例患者中只有13例進行了DNA突變分析,證實為黏脂貯積癥Ⅱ型[36]。這些成功接受造血干細胞移植的黏脂貯積癥Ⅱ型患者血漿中的水解酶(如β半乳糖苷酶、α半乳糖苷酶、α葡糖苷酶、β氨基己糖苷酶、α甘露糖苷酶、β甘露糖苷酶)在移植后的幾個月到幾年仍然有顯著的提高。

雖然目前黏脂貯積癥Ⅱ型疾病沒有良好的根治措施,但是一些有效的支持性治療是必不可少的,比如:幾乎所有黏脂貯積癥Ⅱ型患者都會出現嚴重的牙齦增厚,這會影響日常的牙齒清潔,造成口腔疼痛、感染甚至膿腫,患者可通過牙齦切開術進行治療并保持日常牙齒清潔[37];針對氣道狹窄造成的呼吸功能不全的黏脂貯積癥Ⅱ型患者,雖然因療效有限且存在很大風險而不能進行手術干預,但持續氣道正壓通氣是良好且必要的選擇;對于出現阻塞性睡眠呼吸暫停的黏脂貯積癥Ⅱ型患者,其睡眠質量的監控是很重要的,給予持續氣道正壓通氣能改善黏脂貯積癥Ⅱ型患者的睡眠呼吸狀態;黏脂貯積癥Ⅱ型患者免疫系統功能受損并經常性地出現肺部感染,這對患者的生命造成嚴重威脅,增強其免疫力、減少感染對提高存活率有積極影響[29～30]。當然,遺傳咨詢以及產前診斷能降低黏脂貯積癥Ⅱ型的發生率。

5 展望

以M6P為標記靶向運輸的溶酶體酶的種類多達50種,雖然黏脂貯積癥Ⅱ型患者所有細胞和組織都缺乏N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶活性,其中成纖維細胞和間充質細胞受到的影響最為顯著,但是,許多其他細胞類型(如肝細胞、庫普弗細胞和白細胞)和一些器官(如肝、脾、腎和大腦)的溶酶體水解酶水平接近正常[20],提示可能存在不需要M6P識別標記的溶酶體酶轉運方式。GNPTAB基因突變使溶酶體的基本功能受損,未進入溶酶體的酶、積累的未被分解的大分子物質和潛在的分子信號缺失等對人體細胞、組織、器官乃至系統的影響,都將黏脂貯積癥Ⅱ型引向了更加復雜而嚴重的表型。雖然目前還不能全面地了解和治療黏脂貯積癥Ⅱ型,但是每一個研究進展的取得,都將為我們完整認識黏脂貯積癥Ⅱ型提供重要基礎,也將為患者的精確有效治療帶來希望。