博舒替尼抗食管癌細胞的磷酸化蛋白質組學研究

哈依努爾,梁旭俊,李茂玉,邵美英,付 瑩*,陳 林,陳主初

(1.中南大學湘雅醫院腫瘤科國家衛健委蛋白質組學重點實驗室抗癌藥物國家地方聯合工程實驗室國家老年醫學臨床研究中心,中國湖南 長沙 410008;2.新疆醫科大學第一附屬醫院呼吸科,中國新疆烏魯木齊 830000)

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最常見的惡性腫瘤之一,發病率位居全球惡性腫瘤第8位,死亡率位居腫瘤相關死因第6位[1]。中國是食管癌高發國家,每年新發病例數約占全球新發病例的50%,是世界上食管癌新發病例數最多的國家[2]。目前早期食管癌以手術治療為主,但是大部分患者在確診時已進入中晚期,預后較差,其5年生存率僅為20%左右[3]。因此,尋找有效的分子靶向藥物可為食管癌的治療提供新的思路,具有重要的臨床意義。

食管癌的分子靶向治療已進行多個靶點的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[4～6]。其中,非受體酪氨酸激酶Src在多種腫瘤細胞中高度活化或過表達,能持續激活Ras/MEK、PI3K/AKT、JAK/STAT 等下游信號傳導通路,促進腫瘤細胞增殖和遷移,抑制其凋亡,是食管癌等腫瘤治療的一個有效靶點[7]。臨床試驗證實,針對Src激酶的多種小分子抑制劑在多種腫瘤中取得了良好療效,而且這些小分子抑制劑除了作用于Src外,一般還有其他有效靶點[8～9]。研究顯示,Src/Abl雙效抑制劑達沙替尼在腫瘤細胞中除了抑制Src和Bcr-Abl外,還能有效抑制c-KIT、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)等激酶的活化[10]。博舒替尼(bosutinib,SKI-606)是一種新型的雙重Src/Abl激酶抑制劑,2012年被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準,適用于慢性、加速或急變期慢性粒細胞性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)患者的治療[11],研究證明它能同時阻止多種腫瘤細胞中Src和Abl激酶的磷酸化,具有高效的抗腫瘤細胞增殖活性[12～15],但是除了Src/Abl外,博舒替尼是否還有其他有效作用靶點尚不清楚。我們先前的研究證實博舒替尼顯著抑制人食管癌細胞Eca-109和KYSE450的增殖,促進其凋亡,并且抑制Src、c-Abl及其下游信號通路的激活[16],因此本研究在此基礎上采用磷酸化蛋白質組學方法,探究博舒替尼作用于食管癌細胞的潛在作用靶點及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物

人食管癌細胞Eca-109購自中國科學院細胞庫,用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640培養基培養;博舒替尼(純度＞99%)購自美國Selleck公司,實驗前用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解配制成濃度為20 mmol/L的貯存液,避光保存于-20℃。

1.2 主要試劑與儀器

細胞培養所用RPMI-1640培養基、FBS及iTRAQ標簽試劑、Bradford定量試劑盒、蛋白質上樣緩沖液購自美國Thermo公司;尿素、硫脲、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)、甘氨酸、過硫酸銨、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、TEAB(triethylammonium bicarbonate)和Tris購自美國GE Healthcare公司;蛋白酶抑制劑cocktail和磷酸酶抑制劑購自瑞士Roche公司;DMSO、碳酸氫銨、碘乙酰胺、胰蛋白酶、乙腈(acetonitrile,ACN)、異丙醇、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)和甲酸(formic acid,FA)購自美國Sigma公司。UltiMate 3000 UHPLC、Q-Exactive HF X 質譜儀、High PH RP離心柱、C18色譜柱、Multiskcan FC酶標儀、二氧化碳培養箱均為美國Thermo公司產品;低溫高速離心機(Eppendorf 5430R)為德國Eppendorf公司產品;數據分析軟件Proteome Discoverer為美國Thermo公司產品。

1.3 主要方法

1.3.1 細胞處理

將對數生長期的Eca-109細胞分為兩組,根據博舒替尼抑制食管癌細胞生長的前期實驗結果[16],實驗組加入終濃度為5 μmol/L的博舒替尼,對照組加入等體積的DMSO,置于CO2培養箱中處理4 h。

1.3.2 蛋白質提取與酶解

收集細胞于1.5 mL離心管,加入預冷的含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液,置于冰上5 min;加入終濃度為10 mmol/L的DTT,用超聲破碎儀冰浴超聲2 min,在4℃條件下25 000g離心15 min;取上清并加入終濃度為10 mmol/L的DTT,56℃水浴1 h,冷卻至室溫后加入終濃度為55 mmol/L的碘乙酰胺,避光放置45 min,最后在4℃條件下25 000g離心10 min,收集的上清即為總蛋白質。用Bradford方法對收集的蛋白質進行定量,取100 μg蛋白質按胰蛋白酶∶蛋白質=1∶20的比例加入胰酶,渦旋振蕩后低速離心1 min,隨后37℃水浴2 h,消化后的肽段進行除鹽操作,然后將得到的肽段液冷凍抽干。

1.3.3 肽段標記、富集與分離

用0.5 mol/L TEAB溶解肽段樣品,加入i-TRAQ標簽試劑,室溫靜置2 h,用C18萃取柱脫鹽并抽干;以樣品∶TiO2=1∶4稱取TiO2,加入1 mL蛋白質上樣緩沖液,室溫振蕩10 min,然后加入抽干的肽段,于37℃條件下1 100 r/min振蕩1 h;12 000g離心30 s后保留沉淀,加入1～2 mL上樣緩沖液,室溫圓盤翻轉5 min,12 000g離心30 s后棄上清,然后加入洗滌液洗4次,最后加入洗脫液洗脫,收集上清并抽干。用300 μL 0.1%的TFA復溶抽干的肽段,采用High PH RP小柱進行組分分離,最后合并樣品得到6個組分,冷凍抽干。

1.3.4 高效液相色譜分離及質譜檢測

將抽干的肽段樣品用流動相A(2%ACN,0.1%FA)復溶,20 000g離心10 min后,取上清進樣。通過UltiMate 3000 UHPLC進行分離,樣品首先進入trap柱富集并除鹽,隨后與自裝C18柱(75 μm內徑, 粒徑＞3 μm 柱料,25 μm 柱長)串聯, 以300 nL/min流速通過如下有效梯度:0～5 min,5%流動相B(98%ACN,0.1%FA);5～45 min,流動相B從5%線性升至25%;45～50 min,流動相B從25%升至35%;50～52 min,流動相B從35%升至80%;52～54 min,80%流動相B;54～60 min,5%流動相B。納升液相分離末端直接連接質譜儀。經液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進入到串聯質譜儀Q-Exactive HF X進行DDA(data-dependent acquisition)模式檢測。主要參數:離子源電壓設置為1.9 kV;一級質譜掃描范圍(m/z)為350～1 500,分辨率設置為60 000;二級質譜起始m/z固定為100,分辨率為15 000。二級碎裂的母離子篩選條件:電荷2+到6+,峰強度超過10 000的強度排在前20的母離子。離子碎裂模式為HCD,碎片離子在Orbitrap中進行檢測。動態排除時間設定為30 s。AGC設置:一級為3.0E+06,二級為1.0E+05。

1.3.5 磷酸化蛋白質的鑒定與定量

利用Proteome Discoverer 1.4軟件將質譜產生的原始圖譜文件進行格式轉換,并通過Mascot 2.3對質譜數據進行數據庫搜索,數據庫為人蛋白質序列數據庫human UniProt(20356 sequence)。搜索參數設置如下:酶切方式為胰蛋白酶,最大允許兩個漏切位點,固定修飾為半胱氨酸烷基化,可變修飾為甲硫氨酸的氧化、蛋白質N端的乙酰化、脫酰胺化以及絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化,母離子容忍度為2.0E-05,碎片離子容忍度為0.05 Da。利用Percolator對Mascot搜索的結果進行再處理,以圖譜的錯誤發現率(false discovery rate,FDR)≤0.05過濾得到可信的肽段。利用Proteome Discoverer整合的phosphoRS對鑒定到的磷酸化肽段進行磷酸化位點打分,以phosphoRS probability≥0.75[17]過濾得到可信的磷酸化位點。

1.3.6 磷酸化蛋白質組結果的生物信息學分析

用clusterProfile軟件包[18]對差異磷酸化蛋白質進行GO(Gene Ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集。在蛋白激酶的活性預測中,用KinSwingR軟件包[19]從PhosphoSitePlus數據庫[20]得到已知的355種蛋白激酶的磷酸化位點周圍的氨基酸殘基位置權重矩陣,之后使用位置權重矩陣在差異磷酸化蛋白質組數據中搜索能夠顯著匹配的磷酸化肽段,并根據與特定蛋白激酶的位置權重矩陣相匹配的磷酸化肽段的磷酸化升高或降低來定義蛋白激酶的KS score(KinSwingR Z-score),通過KS score預測蛋白激酶的活性。

在繪制博舒替尼作用的蛋白質網絡中,首先,將差異磷酸化蛋白質和KinSwingR預測的活性顯著變化的蛋白激酶作為輸入因子,從STRING數據庫得到這些蛋白質的相互作用網絡[21];其次,使用Cytoscape軟件中的ClusterOne插件識別蛋白質網絡中的模塊[22];最后,使用BiNGO插件對模塊涉及的生物過程進行富集[23],用Cytoscape 3.2.1軟件繪制相互作用網絡圖。

2 結果

2.1 磷酸化蛋白質組鑒定

采用iTRAQ定量磷酸化蛋白質組學方法分別對博舒替尼和DMSO處理的人食管癌細胞Eca-109中的磷酸化蛋白質組進行鑒定,結果如表1:在2 741個蛋白質上共鑒定到11 335條磷酸化肽段和 7 940個磷酸化位點,其中1 272個蛋白質只鑒定到1個磷酸化位點,534個蛋白質鑒定到兩個磷酸化位點,305個蛋白質鑒定到6個及以上磷酸化位點(圖1A);在鑒定到的7 940個磷酸化位點中,85.45%為絲氨酸(S),13.64%為蘇氨酸(T),0.91%為酪氨酸(Y)(圖1B)。

2.2 差異磷酸化蛋白質的定量分析

以博舒替尼處理的人食管癌細胞作為實驗組,DMSO處理組作為對照組,取兩組數據的比值進行差異磷酸化蛋白質的定量分析。差異磷酸化肽段的篩選標準為差異倍數(fold change)≥1.5或≤0.667,同時P-value≤0.05,結果共篩選到182個差異磷酸化肽段,其中上調55個,下調127個(圖2)。

表1 磷酸化蛋白質組的鑒定結果統計Table 1 The statistics of phosphorylated proteome identification

圖1 蛋白質磷酸化位點的鑒定結果(A)蛋白質的磷酸化位點數分布;(B)磷酸化修飾的氨基酸殘基分布,S代表絲氨酸,T代表蘇氨酸,Y代表酪氨酸。Fig.1 Identification results of protein phosphorylation sites(A)Distribution of phosphorylation sites on proteins;(B)Distribution of phosphorylated amino acid residues.S represents serine,T represents threonine,and Y represents tyrosine.

圖2 磷酸化肽段定量的火山圖紫色圓點代表下調的磷酸化肽段,橙色圓點代表上調的磷酸化肽段,灰色圓點代表無明顯變化的磷酸化肽段。Fig.2 Volcano plot showing quantification of phosphorylated peptide segmentsPurple dots represent down-regulated phosphorylated peptide segments,orange dots represent up-regulated phosphorylated peptide segments,and gray dots represent phosphorylated peptide segments with no significant change.

2.3 差異磷酸化蛋白質的功能富集分析

采用clusterProfile軟件包對差異磷酸化蛋白質涉及的生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細胞組分(cellular component)進行GO富集分析,結果顯示:這些差異磷酸化蛋白質主要位于細胞連接、胞外空間和肌動蛋白骨架等位置,主要參與了mRNA代謝、細胞骨架組織、細胞內其他有機化合物的分解代謝等生物過程;其分子功能主要是結合RNA、細胞骨架蛋白、細胞黏附分子和鋅離子轉運體等(圖3)。

圖3 差異磷酸化蛋白質的GO富集分析(前15位)(A)差異磷酸化蛋白質參與的生物過程富集;(B)差異磷酸化蛋白質的生物功能富集;(C)差異磷酸化蛋白質的細胞定位富集。在每個富集結果中,條形的大小代表富集的基因數量,顏色代表顯著性水平,藍色表示顯著性較低,紅色表示顯著性較高。Fig.3 GO enrichment analysis of the differentially phosphorylated proteins(top 15)(A)Biological processes involving differentially phosphorylated proteins;(B)Molecular functions of differentially phosphorylated proteins;(C)Cellular components of differentially phosphorylated proteins.For each term,the number of enriched genes is indicated by the bar size,while the P-value is represented by the color.Blue indicates a high P-value while red represents a low P-value.

2.4 博舒替尼對細胞增殖、凋亡和遷移相關蛋白質磷酸化水平的影響

對參與細胞增殖、凋亡和遷移相關過程的差異磷酸化蛋白質在博舒替尼處理組和對照組中的磷酸化水平進行比較分析,結果顯示:在增殖相關的蛋白質中,博舒替尼能夠顯著抑制核仁蛋白NOP2、SFRS蛋白激酶 2(SFRS protein kinase 2,SRPK2)等的磷酸化,促進中心體蛋白131(centrosomal protein 131,CEP131)、JUN、核糖體蛋白 S6(ribosomal protein S6,RPS6)等的磷酸化;在凋亡相關的蛋白質中,博舒替尼顯著抑制SRPK2、CD44等的磷酸化,促進JUN、RPS6的磷酸化;在遷移相關的蛋白質中,博舒替尼顯著抑制CD44的磷酸化,促進絲切蛋白1(cofilin 1,CFL1)等的磷酸化(圖 4)。

2.5 差異磷酸化蛋白質的信號通路富集分析

對差異磷酸化蛋白質參與的信號通路進行KEGG富集分析,結果如表2所示:富集的信號通路主要涉及轉錄、翻譯、核糖體相關的信號通路、細胞凋亡相關的信號通路和鋅離子轉運信號通路。這一結果與生物過程的富集相似,且大部分核糖體相關蛋白質的磷酸化水平顯著下調,提示博舒替尼可能通過影響轉錄和翻譯過程進而發揮抑制腫瘤作用。

圖4 博舒替尼對細胞功能相關蛋白質磷酸化水平的影響(A)博舒替尼對細胞增殖相關蛋白質磷酸化水平的影響;(B)博舒替尼對細胞凋亡相關蛋白質磷酸化水平的影響;(C)博舒替尼對細胞遷移相關蛋白質磷酸化水平的影響。圖中顏色表示每個樣本中蛋白質磷酸化水平的程度,紅色表示磷酸化水平較高,藍色表示磷酸化水平較低。Fig.4 Effect of bosutinib on phosphorylation levels of cell function-associated proteins(A)Effect of bosutinib on phosphorylation levels of cell proliferation-associated proteins;(B)Effect of bosutinib on phosphorylation levels of apoptosis-related proteins;(C)Effect of bosutinib on phosphorylation levels of cell migration-related proteins.The color indicates the level of protein phosphorylation in each sample,with red indicating higher levels of phosphorylation and blue indicating lower levels of phosphorylation.

2.6 博舒替尼對蛋白激酶活性影響的預測

采用KinSwingR軟件包、差異磷酸化蛋白質數據以及已知的蛋白激酶和底物的關系對蛋白激酶的活性進行預測分析,結果如圖5所示:cAMP依賴型蛋白激酶A催化亞基α(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha,PRKACA)、極光激酶B(aurora kinase B,AURKB)等激酶的活性顯著降低,而Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)的活性顯著升高,提示這些激酶可能是博舒替尼在食管癌中的潛在作用靶點。

表2 差異磷酸化肽段的KEGG富集結果(前15位)Table 2 KEGG enrichment of differentially phosphorylated peptides(top 15)

圖5 KinSwingR預測蛋白激酶的活性紅色圓點為活性升高的蛋白激酶,藍色圓點代表活性降低的蛋白激酶(P＜0.05)。Fig.5 The kinase activity predicted by KinSwingRRed dots are protein kinases with increased activity,and blue dots are protein kinases with decreased activity(P＜0.05).

2.7 博舒替尼作用的蛋白質網絡分析

為全面了解博舒替尼的作用靶點,我們構建了博舒替尼作用的蛋白質網絡,結果如圖6所示。博舒替尼作用的蛋白質網絡大致可以分為4個功能模塊,主要涉及細胞周期和分裂、細胞骨架組織、RNA轉錄和代謝、細胞凋亡和程序性死亡等生物過程,每個生物過程中包含的蛋白質列于表3。這些模塊涉及的生物過程既有區別又相互聯系,展示了博舒替尼可能的分子機制整體圖景,其中GAPDH、RPS6和JUN在網絡中有最高的連接度,而RPS6和JUN是磷酸化差異較顯著的蛋白質,同時也與腫瘤細胞增殖和凋亡密切相關。

圖6 博舒替尼作用的蛋白質網絡根據網絡中蛋白質涉及的生物學過程可以把該網絡分為4個模塊,分別用紅色、紫色、黃色和綠色的底色表示,每個模塊中包含的生物學過程列于旁側。紅色節點代表磷酸化水平上調的蛋白質,藍色節點代表磷酸化水平下調的蛋白質,綠色節點代表KinSwingR預測的活性顯著變化的蛋白激酶,灰色節點是STRING數據庫中與上述蛋白質存在相互作用的蛋白質。其中,連接度最高的3個蛋白質GAPDH、RPS6和JUN用深紅色突出表示。Fig.6 Protein network of bosutinib actionThe network can be divided into four modules based on the biological processes involved in the proteins,indicated by red,purple,yellow,and green background colors.The biological processes in each module listed beside it.Red nodes represent proteins with up-regulated phosphorylation levels,blue nodes represent proteins with down-regulated phosphorylation levels,green nodes represent protein kinases with significant changes in activity as predicted by KinSwingR,and gray nodes are proteins that have interactions with the above proteins in the STRING database.The three most highly connected proteins,GAPDH,RPS6,and JUN,are highlighted in dark red.

表3 博舒替尼作用的蛋白質網絡中每個模塊涉及的生物學過程及包含的蛋白質Table 3 The related biological processes and proteins in each module of protein network of bosutinib action

3 討論

磷酸化是蛋白質翻譯后修飾的主要形式之一,參與細胞增殖、分化、凋亡、信號傳導、腫瘤發生等各種生理病理過程,而小分子激酶抑制劑一般是通過調節激酶的磷酸化調控相應的信號傳導通路來發揮作用,因此通過蛋白質磷酸化尋找潛在的靶標及作用機制是小分子激酶抑制劑研究的重要策略之一。博舒替尼作為高選擇性小分子Src/Abl雙靶抑制劑,在前列腺癌中通過抑制AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,MAPK)、AKT的磷酸化及骨形態發生蛋白2(bone morphogeneticprotein 2,BMP2)、轉化生長因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)的表達來抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[24];在乳腺癌中通過促進細胞之間的黏附和β-連環蛋白(β-catenin)的膜轉運,抑制AKT、黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(prolinerich tyrosine kinase 2,Pyk2)的磷酸化,從而抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲[25]。我們先前的研究證明博舒替尼可顯著抑制食管癌細胞的增殖,促進其凋亡[16],但其具體作用機制及靶點并不清楚。本研究對博舒替尼作用于食管癌細胞后磷酸化蛋白質組的變化進行檢測和分析,發現除了抑制Src、Abl外,博舒替尼還顯著影響 JUN、RPS6、CD44、SRPK2等蛋白質的磷酸化(圖4),而這些差異磷酸化蛋白質主要參與mRNA代謝、細胞骨架組織、鋅離子轉運等重要生物學過程(圖3),其中JUN、RPS6被鑒定到有多個位點的磷酸化發生變化。大量研究證明,JUN的磷酸化在腫瘤細胞的增殖和凋亡過程中扮演了重要的角色[26～27],一方面JUN的磷酸化影響了其DNA結合能力,另一方面影響了其轉錄激活能力[28];同時也有研究證明,JUN的磷酸化與Abl的激酶活性密切相關,它們之間存在互相激活的循環[29]。RPS6作為核糖體蛋白在正常生理過程中發揮重要作用,同時作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路下游重要分子,參與腫瘤細胞的增殖和凋亡過程[30]。在本研究中,博舒替尼作用引起食管癌細胞RPS6蛋白的S241、S244、S246位點的磷酸化水平發生顯著變化,因此其可能是通過mTOR信號通路發揮作用,而且在博舒替尼作用的蛋白質網絡中,JUN和RPS6也有較高的連接度(圖6),這些結果都提示JUN和RPS6可能是博舒替尼的潛在作用靶點。

蛋白激酶的活性預測結果顯示,PRKACA、PLK1、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶1(calcium/calmodulin-dependent protein kinase type 1,CAMK1)、AURKA和AURKB等蛋白激酶的活性發生顯著變化(圖5)。文獻報道,PRKACA能介導STAT3磷酸化,激活果蠅zeste基因增強子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)[31];PLK1可促進細胞的有絲分裂[32],這些激酶在腫瘤進展中都發揮著重要作用,由此推測這些激酶的活性改變可能是博舒替尼抑制食管癌細胞增殖的重要機制之一。

雖然博舒替尼在CML中顯示出良好的治療效果,但其在實體瘤中的應用及作用機制有待進一步拓展及研究。本文從磷酸化蛋白質組層面揭示了除Src/Abl外博舒替尼在食管癌中潛在的作用靶點及作用機制,為其在食管癌中的應用奠定了理論基礎,同時也為其在其他腫瘤中的研究提供了一定的科學依據。