腫瘤發(fā)生對小鼠胸腺發(fā)育及T細胞生成的影響

劉 霖,湯 婧,邢 兵,李 鑫,陳 瑩,周祖平,蒲仕明*

(1.廣西師范大學a.生命科學學院;b.生物醫(yī)學研究中心,中國廣西 桂林 541004;2.廣西高校干細胞與醫(yī)藥生物技術重點實驗室,中國廣西 桂林 541004)

在哺乳動物中,胸腺是T細胞發(fā)育、分化、成熟并向外周輸出T細胞的場所。其能通過分泌各種胸腺激素,調節(jié)機體的免疫功能[1]。胸腺作為T細胞發(fā)育、分化的重要器官,在接收來自骨髓的原胸腺細胞(prothymocyte)后,相繼分化為前胸腺細胞(prethymocyte)、CD4-CD8-T 細胞、CD4+CD8+T細胞,最后分化為成熟的細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL;CD4-CD8+T細胞)或輔助性T細胞(T helper cell,Th cell;CD4+CD8-T 細胞)[2]。

成熟的T淋巴細胞負責細胞免疫,其直接消滅侵入機體的病原微生物,監(jiān)視和清除體內出現的癌變細胞、衰老死亡的細胞等,具有促進免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)的作用,因此胸腺在抗衰老、抗感染、抗腫瘤及自身免疫性疾病中起著重要作用[3]。一直以來,腫瘤對胸腺發(fā)育及T細胞功能影響的研究受到人們的關注。小鼠膠質瘤模型的研究表明,模型小鼠的胸腺質量減輕,組織學結構發(fā)生改變[4]。另有研究表明,小鼠纖維肉瘤在10 d內引起胸腺萎縮,這種胸腺萎縮的特征是細胞數量減少,成熟胸腺細胞百分比增加,組織學上胸腺皮質減小,未成熟胸腺細胞中增殖細胞百分比增加[5]。Sun等[6]提出,CD8+T細胞不能有效地獨立消除H22腫瘤細胞,而CD4+T細胞被腫瘤抑制,這樣機體只會增強胸腺中T細胞的分化和成熟,并將其釋放到實體腫瘤中以增強抗腫瘤免疫能力,引起惡性循環(huán),最終導致胸腺萎縮。研究表明,BALB/c小鼠在營養(yǎng)不良或感染的情況下,胸腺組織發(fā)生明顯的萎縮[7];腫瘤的發(fā)生與免疫細胞生成的內部紊亂有關聯[8],特別是髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)——一類大量積聚在腫瘤模型動物或癌癥病人的骨髓、血液、脾臟以及癌組織中的未成熟髓系抑制細胞[9～10]。因此,本研究構建小鼠肺癌模型,采用HE染色分析小鼠胸腺形態(tài)學變化,并利用流式細胞術分析小鼠胸腺、外周血中T細胞亞群的豐度及外周血中MDSCs的含量,旨在探索腫瘤發(fā)生對胸腺發(fā)育的影響,為明確腫瘤調控機體免疫系統(tǒng)提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗所使用的C57BL/6小鼠(體重相近的8周齡雄鼠)購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,飼養(yǎng)于廣西師范大學實驗動物中心。小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)細胞購買于中國科學院細胞庫,產品號:KCB20781YJ。

1.1.2 實驗試劑

Anti-mouse CD3-APC、anti-mouse CD4-PE、anti-mouse CD8-PE-Cy7、anti-mouse Gr-1-PE、anti-mouse CD11b-PE-cy7、anti-mouse CD3e functional grade purified、anti-mouse CD28 functional grade purified以及CFSE proliferation dye源自e-Bioscience公司(美國),胎牛血清和DMEM Basic(1×)培養(yǎng)基購自 Gibco公司(美國),20×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、膠原酶Ⅱ、紅細胞裂解液、蘇木素染液、石蠟和伊紅染液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器

流式細胞分選/分析儀(Becton Dickinson公司,美國);普通光學顯微鏡、熒光倒置顯微鏡(Nikon公司,日本);冷凍離心機、超純凈去離子水組合系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific公司,美國);石蠟切片機和石蠟包埋儀(上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺癌模型的構建

培養(yǎng)LLC細胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的80%左右,用胰蛋白酶將其消化成單個懸浮細胞,經PBS洗滌(300g)兩次后稀釋成密度為2.5×106mL-1的細胞懸液。將0.2 mL細胞懸液注射至小鼠左腋皮下(5×105個/只),對照組注射等量的PBS。小鼠飼養(yǎng)4周,選擇腫瘤直徑不小于1.5 cm的荷瘤小鼠用于后續(xù)實驗。

1.2.2 小鼠胸腺指數的測定

稱量小鼠體重(g)后將其頸椎脫臼處死,置于75%乙醇中5～10 s。用剪刀和鑷子打開小鼠胸腔,取出胸腺放于PBS中清洗兩次,隨后將胸腺置于濾紙上吸干水分,并立即用電子天平進行稱重(mg)。胸腺指數(mg/g)=胸腺質量(mg)/體重(g)。

1.2.3 小鼠胸腺石蠟切片的制作和HE染色

處死小鼠,取出胸腺置于波氏固定液中進行固定過夜。用流水沖洗胸腺組織過夜至表面固定液顏色(黃色)基本褪去。將固定好的胸腺依次置于梯度濃度的乙醇溶液(50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)中,各脫水20 min;再依次置于乙醇-二甲苯等體積混合液、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中,各滲透10 min;將完成滲透的胸腺組織置于60℃石蠟中滲透石蠟2～3 h;隨后進行石蠟包埋、切片(蠟片厚度為 4～5 μm)、展片(38 ℃液面)、烤片(58 ℃處理4 h后37℃過夜)。將上述切片材料依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、乙醇-二甲苯等體積混合液中,各脫蠟10 min;再置于逆濃度梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%)中,各浸泡3 min;室溫條件下用蘇木素染液染色10～15 min,分化液浸洗3～5 s,再用伊紅染液染色5 min;隨后將切片依次置于95%乙醇、100%乙醇、乙醇-二甲苯等體積混合液中,各脫水2 min,緊接著二甲苯透明2 min,最后封片用于鏡檢。

1.2.4 小鼠胸腺細胞的制備及流式細胞術分析

取小鼠胸腺置于PBS中,經剪碎后用0.1%膠原酶Ⅱ于37℃消化15 min,隨后用PBS洗滌兩次(500g,下同)。過濾后用PBS重懸細胞,進行細胞計數。取約1.0×107個細胞于4℃避光條件下孵育anti-mouse CD4和anti-mouse CD8熒光偶聯抗體30 min,經PBS清洗、重懸后進行流式細胞術分析。

1.2.5 骨髓單細胞懸液的制備及MDSCs的分選

頸椎脫臼處死小鼠后將其浸泡于75%乙醇中5～10 s,分離出小鼠脛骨與股骨并將其轉移至超凈工作臺,用75%的乙醇浸泡脛骨與股骨15 s后,用無菌PBS浸洗兩次。剪開脛骨與股骨兩端,用吸有DMEM完全培養(yǎng)基的1 mL注射器將骨髓組織吹出。用移液器反復吹培養(yǎng)基至形成骨髓單細胞懸液。離心棄上清,對骨髓細胞用紅細胞裂解液裂解2 min,隨后用PBS清洗兩次。將所得骨髓細胞用anti-mouse CD11b和anti-mouse Gr-1熒光偶聯抗體孵育30 min,經PBS清洗、重懸后用于流式細胞術分選MDSCs。

1.2.6 小鼠外周血有核細胞的制備及流式細胞術分析

對小鼠進行眼眶取血,將血液滴入盛有3 mL 0.5%肝素鈉溶液的離心管中,并迅速混合。離心棄上清后,用PBS洗滌兩次。加入紅細胞裂解液裂解5 min后,用PBS清洗兩次。將所得外周血有核細胞分為兩組,一組于4℃避光條件下孵育anti-mouse CD3、anti-mouse CD4 和 anti-mouse CD8熒光偶聯抗體30 min,用于分析T細胞的豐度;另一組在同樣條件下孵育anti-mouse CD11b和anti-mouse Gr-1熒光偶聯抗體,用于分析MDSCs的豐度。

1.2.7 非特異性T細胞增殖抑制

將羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimide ester,CFSE)工作液加入到胸腺單細胞懸液并快速混勻(終濃度為5 μmol/L),室溫下避光孵育10 min,用冰冷的DMEM完全培養(yǎng)基清洗細胞3次后進行細胞計數。將上述經CFSE染色的胸腺細胞(4×105個)接種于96孔板中,隨后分別向每孔加入分選獲取的腫瘤小鼠來源的MDSCs或正常小鼠來源的MDSCs(2×105個)共培養(yǎng)(胸腺細胞∶MDSCs=2∶1),空白組(Medium)加入等量的PBS(胸腺細胞∶MDSCs=2∶0)。此外,每孔加入 anti-mouse CD3e functional grade purified、anti-mouse CD28 functional grade purified抗體(終質量濃度為0.5 μg/mL)刺激T細胞增殖。混合均勻后在CO2培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。72 h后收集細胞,經PBS清洗和重懸后分析CFSE的熒光強度,以確定T細胞的增殖情況。

1.2.8 數據處理

流式細胞術所得數據由FlowJo7流式分析軟件分析;柱形圖生成與數據統(tǒng)計采用GraphPad Prism軟件,并進行獨立樣本t-test分析。數據結果以平均值±標準差(±s)表示,P＜0.05表示統(tǒng)計學上有顯著性差異(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001)。

2 結果

2.1 腫瘤狀態(tài)下小鼠胸腺發(fā)生萎縮

利用LLC細胞構建小鼠肺癌模型(圖1A),分別取出荷瘤小鼠(Tumor)與對照組小鼠(Normal)的胸腺稱重,獲取小鼠胸腺質量,并計算其胸腺指數。結果表明,與正常小鼠的胸腺相比,腫瘤狀態(tài)下小鼠胸腺的體積和質量均明顯減小(圖1B,C),胸腺指數也顯著降低(圖1D),提示腫瘤發(fā)生中胸腺發(fā)育受阻,胸腺器官萎縮。

圖1 小鼠胸腺質量及指數分析(A)小鼠肺癌模型圖;(B)小鼠胸腺對比圖;(C)小鼠胸腺質量分析;(D)小鼠胸腺指數分析。Fig.1 Analysis of mouse thymus mass and index(A)The mouse model of lung cancer;(B)Comparison of thymus samples;(C)Analysis of thymus mass of mice;(D)Analysis of thymus index of mice.

2.2 腫瘤發(fā)生中小鼠胸腺皮/髓質比下降

為分析腫瘤狀態(tài)下小鼠胸腺的發(fā)育情況,分別對正常小鼠和荷瘤小鼠的胸腺進行病理切片分析(圖2)。結果表明,正常小鼠胸腺皮質較厚,細胞排列緊密;荷瘤小鼠胸腺皮質變薄,細胞排列稀疏。此外,正常小鼠胸腺的皮質比例高于荷瘤小鼠胸腺的皮質比例。以上信息提示,腫瘤發(fā)生中未成熟T細胞生成可能受阻。

圖2 正常小鼠和荷瘤小鼠胸腺組織的形態(tài)學比較1:小鼠胸腺的皮質區(qū);2:小鼠胸腺的髓質區(qū)。Fig.2 Morphological comparison of thymus tissues in normal and tumor-bearing mice1:The cortical region of the mouse thymus;2:Medullary region.

2.3 腫瘤狀態(tài)下胸腺T細胞亞群顯著下降

為分析腫瘤發(fā)生中胸腺T細胞發(fā)育的變化,對正常小鼠和荷瘤小鼠的胸腺細胞進行流式細胞術分析(圖3)。結果顯示:與對照組相比,荷瘤小鼠胸腺中未成熟CD4+CD8+T細胞的豐度明顯降低(Normal vs.Tumor:77.50%±1.761%vs.68.67%±2.136%)(圖3C);成熟的CD4-CD8+T細胞(Normal vs.Tumor:2.09%±0.112%vs.4.25%±0.219%)和CD4+CD8-T細胞(Normal vs.Tumor:14.23%±1.497%vs.20.97%±1.481%)的豐度均顯著升高(圖 3D,E)。為充分討論胸腺在腫瘤發(fā)生中的變化規(guī)律,本研究對胸腺分離的單個細胞進行了計數(圖3F),計算了胸腺中各T細胞亞群的絕對數量(胸腺單細胞數×細胞豐度)。結果表明,胸腺中未成熟的CD4-CD8-T 細胞[Normal vs.Tumor:(39.51±3.702)×105vs.(8.99±2.446)×105]、CD4+CD8+T 細胞[Normal vs.Tumor:(60.01±3.568)×106vs.(12.16±4.012)×106]和成熟的CD4-CD8+T細胞[Normal vs.Tumor:(1.63±0.164)×106vs.(0.69±0.178)×106]、CD4+CD8-T 細胞[Normal vs.Tumor:(13.51±1.271)×106vs.(3.19±0.820)×106]的絕對數量在腫瘤狀態(tài)下均明顯減少(圖3G～J),這提示腫瘤發(fā)生中胸腺產生的成熟T細胞(CD4+CD8-T細胞和CD4-CD8+T細胞)、未成熟T細胞的絕對數量均顯著下降。上述結果揭示,腫瘤發(fā)生導致胸腺發(fā)育異常,T細胞分化與增殖受阻。

2.4 腫瘤發(fā)生中外周血T細胞含量明顯下降

為評估腫瘤狀態(tài)下小鼠的免疫功能,本研究檢測了外周血有核細胞中T細胞的含量,結果如圖4。腫瘤狀態(tài)下CD4+T細胞(4.59%±0.118%)和CD8+T細胞(3.69%±0.402%)的含量較正常小鼠CD4+T細胞(17.85%±0.988%)和 CD8+T細胞(12.94%±0.694%)的含量顯著降低,提示腫瘤發(fā)生中小鼠細胞免疫功能下降。

2.5 腫瘤發(fā)生中髓源性抑制細胞具有更強的免疫抑制作用

腫瘤發(fā)生中,MDSCs抑制T細胞的增殖與活化。為闡明腫瘤發(fā)生中胸腺萎縮和T細胞數量下降潛在的原因,本研究分析了小鼠外周血中MDSCs的產生情況和MDSCs在腫瘤狀態(tài)下的免疫抑制作用。結果顯示,在腫瘤狀態(tài)下,小鼠外周血中MDSCs比例顯著增加(Normal vs.Tumor:8.15%±0.646%vs.72.23%±1.789%)(圖 5A,C)。在非特異性免疫抑制實驗中,荷瘤小鼠和正常小鼠骨髓來源的MDSCs與胸腺細胞1∶2共培養(yǎng)時,T細胞的增殖指數分別為7.61%±0.871%和11.50%±0.608%,空白組中T細胞的增殖指數為27.34%±2.006%(圖5B,D)。以上數據說明荷瘤小鼠中產生了更多的MDSCs,且腫瘤來源的MDSCs具有更強的免疫抑制能力。上述結果揭示,腫瘤進程中產生了更多具有更強免疫抑制能力的MDSCs,其嚴重抑制T細胞的增殖與活化,可能是胸腺萎縮以及T細胞發(fā)育受阻的重要原因。

圖3 小鼠胸腺T細胞豐度及絕對細胞數量分析(A)小鼠胸腺代表性流式細胞術分析圖;(B～E)小鼠胸腺CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD8+、CD4+T細胞的豐度分析;(F)小鼠胸腺細胞的計數;(G～J)小鼠胸腺 CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD8+、CD4+T 細胞的絕對數量。Fig.3 Abundance and absolute cell number of mouse thymus T cells(A)Representative flow cytometric analysis of mouse thymus;(B～E)Abundance analysis of CD4-CD8-,CD4+CD8+,CD8+,and CD4+T cells in mouse thymus;(F)Counting number of mouse thymus cells;(G～J)Absolute number of CD4-CD8-,CD4+CD8+,CD8+and CD4+T cells in mouse thymus.

3 討論

在哺乳動物中,隨著年齡的增長,胸腺組織會發(fā)生增齡性萎縮,這屬于生理性萎縮。不論是生理性萎縮還是病理性萎縮,必然會對機體的免疫功能產生直接的影響。Sizova等[11]研究發(fā)現,惡性黑色素瘤細胞能潛藏在萎縮的胸腺中而免于抗癌藥物的殺傷,而且萎縮的胸腺還能為腫瘤的復發(fā)和轉移提供惡性儲備。長期以來,衰老與萎縮胸腺的功能回復之間的關系備受關注,然而,人們對腫瘤狀態(tài)下胸腺T細胞的發(fā)育機制知之甚少。因此,文中以LLC細胞誘導的小鼠肺癌模型為研究對象,對腫瘤狀態(tài)下胸腺形態(tài)及其T細胞的豐度變化進行了分析,檢測了外周血中部分終端分化的免疫細胞含量,并且還檢測了MDSCs對T細胞的免疫抑制作用,旨在詮釋腫瘤影響下胸腺T細胞的發(fā)育及腫瘤狀態(tài)下機體免疫系統(tǒng)的變化規(guī)律。

圖4 小鼠外周血T淋巴細胞的豐度分析(A)小鼠外周血T細胞代表性流式細胞術分析圖;(B)小鼠外周血CD4+T細胞豐度的統(tǒng)計分析;(C)小鼠外周血CD8+T細胞豐度的統(tǒng)計分析。Fig.4 T lymphocyte abundance analysis in mouse peripheral blood(A)Representative flow cytometry analysis of mouse peripheral blood T cells;(B)Statistical analysis of CD4+T cell abundance in peripheral blood of mice;(C)Statistical analysis of CD8+T cell abundance in peripheral blood of mice.

圖5 MDSCs豐度及其免疫抑制分析(A)小鼠外周血MDSCs代表性流式細胞術散點圖;(B)CFSE熒光衰減的流式細胞術分析;(C)小鼠外周血MDSCs豐度的統(tǒng)計分析;(D)MDSCs免疫抑制的統(tǒng)計分析。Fig.5 Abundance and immunosuppressive analysis of MDSCs(A)Representative flow cytometry scatter plots of MDSCs in mouse peripheral blood;(B)Flow cytometry analysis of CFSE fluorescence decay;(C)Statistical analysis of MDSC abundance in peripheral blood of mice;(D)Statistical analysis of immunosuppression of MDSCs.

本研究發(fā)現,腫瘤發(fā)生會導致胸腺萎縮(圖1),其產生的T細胞發(fā)育異常,CD4+和CD8+T細胞在胸腺中的含量異常增加(圖3D,E),這可能是胸腺中皮/髓質比在荷瘤小鼠中下降造成的(圖2)。既往的研究表明,T細胞未成熟階段在胸腺皮質內分化,而CD4+CD8-或CD4-CD8+T細胞在胸腺髓質中成熟[12]。盡管腫瘤狀態(tài)下成熟T細胞的豐度顯著增加,但是胸腺中總的細胞數量是減少的(圖3F),繼而向外周輸出的T細胞減少(圖4);另外,上游CD4-CD8-、CD4+CD8+T細胞數量下降顯著(圖3G,H),是導致胸腺、外周血中CD4+和CD8+T細胞減少的直接因素。腫瘤發(fā)生中,髓系細胞成熟受阻,致使未成熟髓系細胞(髓源性抑制細胞)積累。研究顯示,積累的MDSCs對T細胞的活化與增殖有顯著的抑制作用,是腫瘤發(fā)展和逃逸的關鍵[13～14]。本研究在荷瘤小鼠中檢測出大量的MDSCs(圖5C),這些積累的MDSCs可能是導致胸腺萎縮的主要原因。胸腺中T細胞減少的另一個主要原因可能是骨髓向胸腺輸入的原胸腺細胞下降。課題組前期的研究表明,腫瘤發(fā)生中,骨髓共同淋巴祖細胞(common lymphoid progenitors,CLPs)的生成下降[15]。與之相對應,髓系干/祖細胞偏向髓系分化和增殖,致使MDSCs積累,從而抑制T細胞增殖與活化,促進腫瘤發(fā)展與逃逸[16]。

綜上所述,在腫瘤狀態(tài)下,胸腺發(fā)生明顯萎縮,胸腺指數下降,胸腺皮/髓質比下降,T細胞生成能力顯著減弱,其中未成熟的T細胞數量下降尤為顯著;同時,外周血中T細胞含量顯著下降,MDSCs顯著增加,且腫瘤條件下MDSCs對T細胞增殖具有顯著的抑制能力。這些結果揭示,在LLC細胞構建的腫瘤模型中,造血干/祖細胞偏向髓系細胞分化,并且髓系細胞具有更強的免疫抑制作用,抑制T細胞的增殖與活化,這可能是導致胸腺萎縮、T細胞增殖和活化受阻的主要原因。