抗感染植物中藥聯(lián)用抗菌藥物對肺炎克雷伯菌殺菌率和細(xì)菌內(nèi)毒素釋放量的影響＊

習(xí)丹 ，張后富 ，李海 ，何桂林 ，李青

（1.江西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，南昌 330006；2.江西省中醫(yī)藥研究院科研處，南昌 330046；3.北京大學(xué)深圳人民醫(yī)院藥劑科，深圳518000）

關(guān)健詞：抗菌藥物；中藥；殺菌率；內(nèi)毒素釋放量

細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床誘發(fā)休克并導(dǎo)致患者死亡的主要因素之一，而抗菌藥物在殺死（抑制）致病微生物的同時會誘導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)毒素的釋放，并使其進(jìn)入血液循環(huán)[1]。由于抗菌藥物誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥與細(xì)菌和抗菌藥物的種類、濃度、給藥方式等均有關(guān)[2]，因此，選擇具有拮抗細(xì)菌內(nèi)毒素抗菌藥物就成為臨床治療該類疾病的難點。而據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)[3-5]具有清熱解毒作用的抗感染植物中藥及其注射液有抗內(nèi)毒素作用。本文模擬臨床用藥，將炎琥寧、穿琥寧、膽木、喜炎平分別與4種抗菌藥物聯(lián)用，考察其用對肺炎克雷伯菌殺菌率和細(xì)菌內(nèi)毒素釋放量，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；SW-CJ-1D無菌操作臺（北京華威興業(yè)科技有限公司）；DHP-9052細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海合恒儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 菌株與試劑 肺炎克雷伯氏菌廣臨檢-57（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；鱟試劑（廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號：171126，靈敏度0.25EU/支，規(guī)格：0.1ml/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品研究院，批號：2017-08，效價：100EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，批號：1705669）。

1.3 藥物 注射用頭孢哌酮（蘇州東瑞制藥有限公司，批號：1701552）；氧氟沙星注射液（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：170630）；硫酸依替米星注射液 （無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，批號：170903）；注射用炎琥寧（悅康藥業(yè)集團有限公司，批號：170221）；穿琥寧注射液（山東益健藥業(yè)有限公司，批號：170910）；膽木注射液（海南制藥廠有限公司，批號：171126）；喜炎平注射液（江西青峰藥業(yè)有限公司，批號：20170826）。試驗中所使用的其它試劑均為分析純。

1.4 方法 ⑴標(biāo)準(zhǔn)菌株液的制備：鋪MH瓊脂板，將肺炎克雷伯菌接種于MH瓊脂平板上，置培養(yǎng)箱中于35-～36℃孵育過夜，挑取單個菌落接種于生理鹽水中，麥?zhǔn)奖葷岷笫购考s為0.5cfu/ml。⑵藥物最小抑菌濃度（MIC）的測定：按微量肉湯稀釋法測得頭孢哌酮對肺炎克雷伯的MIC為0.061μg/ml,氧氟沙星的 MIC 為 0.038μg/ml，依替米星的MIC為7.88μg/ml,并且與實驗濃度的炎琥寧、穿琥寧、膽木、喜炎平分別聯(lián)用時，其MIC無變化。⑶中藥實驗濃度確定：中藥實驗濃度按藥品說明書規(guī)定的一次用量平均值與人體血液量的比值確定，人體體液約占體重的60%，以平均體重60kg計算，人體血液量為36000ml，計算結(jié)果炎琥寧為0.39mg/ml,穿琥寧為0.35mg/ml,膽木為 0.16mg/ml,喜炎平為0.22mg/ml。⑷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及可靠性實驗[6]：用內(nèi)毒素檢查用水稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，使其細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度分別為5.00、0.50、0.05 EU/ml，各取0.10ml分別加到預(yù)先加有0.10ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)混合均勻，插入BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀進(jìn)行檢測，每一濃度平行測定兩管，并做陰性對照兩管，3個濃度反應(yīng)時間在476s-1863s，而陰性對照管反應(yīng)時間>3600s。標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgT=2.6936-0.2867LgC,r=0.9996(2015年版《中國藥典》要求r絕對值≥0.980)，故標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求。⑸確定抗菌藥物實驗濃度：有報導(dǎo)[7]，抗菌藥物最佳殺（抑）菌濃度為抗菌藥物濃度的10倍MIC值，超過該濃度抗菌藥物的殺（抑）菌效果并不隨濃度的增加而增強，故本實驗以10倍MIC濃度為實驗濃度。⑹實驗藥物干擾試驗：用無熱原水將各實驗藥物按實驗用濃度稀釋。每一稀釋液分成2份,一份不加入內(nèi)毒素作為樣品液,另一份加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（含量為0.5EU/ml）,作為陽性對照液。取上述配制好的樣品液以及陽性對照液0.1 ml,分別加到預(yù)先加有0.1 ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)混勻,迅速插入內(nèi)毒素檢測儀,每一樣品平行2管,并做陰性對照2管。以臨界時間均值參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算內(nèi)毒素濃度,用陽性對照液的回收率來確定其干擾現(xiàn)象。結(jié)果顯示各個樣品的內(nèi)毒素回收率均在85%-115%之間,符合中國藥典規(guī)定,顯示各稀釋濃度無干擾。⑺實驗藥物的配制：將頭孢哌酮、氧氟沙星、依替米星分別加入4種中藥為聯(lián)合用藥組；頭孢哌酮、氧氟沙星、依替米單用為對照組；各組配制好后加入標(biāo)準(zhǔn)菌株液，使細(xì)菌含量為0.5cfu/ml。⑻細(xì)菌計數(shù)和內(nèi)毒素釋放實驗：按(7)項下配置好的各組樣品置35-37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,取出樣品。用顯微鏡直接計數(shù)法測細(xì)菌含量；各樣品稀釋5000倍,按動態(tài)比濁法鱟實驗測其內(nèi)毒素的量,每一濃度平行測定2管；同時按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及陰性對照，實驗3 d操作一次,共3批。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 22.0軟件對殺菌率和細(xì)菌內(nèi)毒素釋放量分別作單因素方差分析和t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物與中藥聯(lián)用對殺菌率的影響 頭孢哌酮、氧氟沙星、依替米星3種抗菌藥物的殺菌率都在94%以上，3種抗菌藥物與中藥聯(lián)用后對殺菌率沒有明顯提高，結(jié)果見表1。

2.2 中藥與抗菌藥物聯(lián)用對細(xì)菌內(nèi)毒素的影響頭孢哌酮、氧氟沙星、依替米星聯(lián)用喜炎平、炎琥寧、穿琥寧釋放的細(xì)菌內(nèi)毒素量比單用抗菌藥物有明顯減少，差異具有顯著性，顯示喜炎平、炎琥寧、穿琥寧具有減少抗菌藥物誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生內(nèi)毒素的作用，而3種抗菌藥物聯(lián)用膽木與單用抗菌藥物釋放的內(nèi)毒素?zé)o顯著差異，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 抗感染植物中藥臨床常用于各種感染性疾病的治療 雖然其臨床效果不及抗菌藥物，但有報導(dǎo)[5,10]，抗感染植物中藥如喜炎平等具有抗內(nèi)毒素功能。本實驗結(jié)果表明，喜炎平、炎琥寧、穿琥寧與抗菌藥物聯(lián)用，雖然不能提高抗菌藥物的殺菌率，但能減少細(xì)菌內(nèi)毒素量的釋放。

3.2 抗菌藥物與不同的抗感染植物中藥聯(lián)用 其抑制細(xì)菌內(nèi)毒素釋放量不同,這除與抗菌藥物誘導(dǎo)內(nèi)毒素釋放情形不盡相同[8,9]外（如β-內(nèi)酰胺類主要作用于青霉素結(jié)合蛋白 (PBP),可殺滅菌體而釋放大量內(nèi)毒素(LPS),而非作用于PBP的抗菌藥物如氨基苷類、喹諾酮類使細(xì)菌釋放內(nèi)毒素較少），還與抗感染植物中藥本身的抗內(nèi)毒素功效有關(guān)[4]。

表1 抗菌藥物與中藥聯(lián)用對殺菌率和細(xì)菌內(nèi)毒素的影響（n=3）

抗菌藥物聯(lián)用喜炎平、炎琥寧、穿琥寧、膽木，不管是MIC還是4 h殺菌百分率都沒有顯著差異性，說明頭孢哌酮、氧氟沙星、依替米星與4種中藥聯(lián)用對抗菌藥物的殺菌率幾無影響。

本實驗中，雖然抗菌藥物與抗感染植物中藥聯(lián)用不能提高抗菌藥物的殺菌率，但上述藥物的聯(lián)用卻能減少誘導(dǎo)細(xì)菌釋放內(nèi)毒素數(shù)量，其中與喜炎平、炎琥寧、穿琥寧聯(lián)用具有顯著性差異，表明喜炎平、炎琥寧、穿琥寧抗內(nèi)毒素作用不受抗菌作用的影響，而膽木的抗內(nèi)毒素作用差異不明顯。提示人們，臨床在治療革蘭氏陰性菌嚴(yán)重感染的患者，在使用高效、敏感的抗菌藥物的同時，可以選擇與喜炎平、炎琥寧、穿琥寧聯(lián)合使用，以降低內(nèi)毒素血癥及其引起的機體損傷。