CRISPR/Cas9 和堿基編輯器
——農業動物研究領域的新利器

江浩筠，幸宇云

（江西農業大學 省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，江西 南昌 330045）

自20世紀80年代起，轉基因技術及其產品逐漸進入公眾的視野，引發了大眾的廣泛專注，也產生了針對轉基因技術安全性的激烈爭論。當今時代，日新月異的技術革新正向我們昂首走來，3D打印、人工智能、云計算、人造肉、商業載人航天飛船等，在各類新聞報道中不斷涌現。作為在現代生物技術中占有重要地位的轉基因技術，也產生了革命性的技術創新，逐步升級成更高效、更安全的基因組編輯技術，近幾年又衍生出堿基編輯技術，使得科研人員能“輕而易舉”地對基因組進行特定位置單個堿基的精準修飾。本文以科普的寫作手法，簡述了轉基因技術由“傳統粗放”到“現代精細化”的發展歷程，剖析了基因組編輯技術相比傳統轉基因技術在生物安全性上的優勢，并重點闡述了基因組編輯的代表性技術——CRISPR/Cas9及其衍生技術（堿基編輯器）在農業動物研究領域可以發揮的作用。

1 傳統的轉基因技術及應用

轉基因技術是指將人工分離和修飾過的基因導入到受體生物中，使導入的外源基因在受體中表達并引起性狀改變的技術。自1982年全世界第一只產生明顯性能改變的轉基因動物[1]和1983年全球第一例轉基因植物[2]研制成功以來，轉基因技術在生物技術領域發揮了舉足輕重的作用，對人類生活產生了重要的影響。在植物領域，抗蟲棉花、抗蟲水稻、抗蟲玉米、抗除草劑大豆、抗病毒木瓜、耐儲存番茄等轉基因產品， 早已滲入到公眾的日常生活中。 以美國為例， 美國是最早進行轉基因作物商業化種植的國家，也一直是轉基因作物的種植和消費大國，轉基因食品已成為美國民眾餐桌上的“家常便飯”[3-4]。在動物研究領域，轉基因技術也發揮了出色的作用。2006年，利用轉基因山羊乳汁中產生的抗人凝血酶III蛋白，成為了國際上首例獲準上市的由轉基因動物生產的基因工程蛋白藥物，為患有先天性抗凝血酶缺失癥的病人帶來了福音；又如，科學家們研制的各種轉基因小鼠模型，為人類健康和醫學發展做出了重要的貢獻。不過對于科研工作者，轉基因技術有個“令人頭疼”的地方，那就是外源基因整合入受體生物時，往往比較“隨心所欲”，整合的位置和數量都不太容易操控。

雖然轉基因技術為人類社會做出了重要的貢獻，從第一種轉基因食品上市至今也有近30年的歷史，但不少民眾對轉基因食品的安全性仍存在疑慮。擔心的焦點問題之一是，食用轉基因食品后，轉入基因所表達的蛋白質是否會對人的健康產生不利影響？另外，轉入的基因一般需要“安裝”在一個載體上，載體中的骨架序列也會進入到受體中，這些序列是否會存在一些潛在的威脅呢？非常明晰的是，所有生命體的DNA序列都是由A、T、C、G四個堿基按不同的排列組合所構成，而我們每天所進食的動植物產品，也都是由DNA及其所表達的蛋白質所組成。這些物質進入人體后，都將被酶分解成小分子；從這個角度看，轉基因食品和傳統的食品是無差別的。還有，自然界中廣泛存在的雜交動植物品種，即是不同品種之間大量DNA的重新組合，這本身就是一種“廣義的轉基因”。需要說明的是，所有的轉基因食品在上市前均需經過嚴格、系統、復雜的生物安全評價，只有評估合格的才能走向市場；轉基因產品上市至今，其中的轉基因大豆、玉米和油菜等大規模生產、食用，均未發現安全性問題。正是由于轉基因技術有目共睹的貢獻及長期論證后的安全可靠，2016年近百位諾貝爾獎獲得者聯名簽署公開信支持轉基因技術，截止2019年11月，簽名的諾貝爾獎得主人數達到了151位，這代表了科學家群體共同的聲音。

2 基因組編輯技術及其在動物研究領域的應用

傳統的轉基因技術會帶入除目標基因之外的多余序列，且整合一般是隨機的，這是導致安全爭論的重要原因之一。那是否有更精準的技術以克服上述問題呢？答案是肯定的，這就是基因組編輯技術?；蚪M編輯是指利用特異性的核酸酶切割目標DNA序列，然后通過不帶“模板”的修復敲除基因、或通過帶“模板”的修復以修飾基因組。相比傳統的轉基因技術，基因組編輯技術的安全性得到了顯著提升。基因組編輯技術有“指哪打哪”的技術特長；另外，修復“模板”的兩端（稱為同源臂）與受體的DNA序列完全相同，同源臂之間是想要導入的目標序列，除目標序列外不會帶入多余的序列。迄今已成功應用的基因組編輯技術有ZFN、TALEN和CRISPR-Cas，這3種技術分別在2002、2011和2012年被報道成功應用[5]。在這3種技術中，CRISPR-Cas“家族”中的CRISPR-Cas9系統，因其操作簡單、效率高、成本低等原因而備受推崇。CRISPR-Cas9系統是在CRISPR上“裝載”一段目標DNA中的特有序列（約20個堿基），這段特有序列在CRISPR中發揮“精確制導”的作用，指揮Cas9酶將特定位置的DNA雙鏈切開一個口子，然后在修復的過程中通過人為設計的“模板”以精準修飾基因組，或不添加“模板”以實現基因敲除。

CRISPR-Cas9可以說是生命科學領域中的一項革命性技術，該技術從誕生到現在不到10年的時間，但其應用呈現出爆發式增長，在許多研究領域都取得了眾多“亮眼”的成果，其中包括在農業動物領域。這里列舉幾項代表性成果。結核病是一種人畜共患病，該病是奶牛場每年的必檢疫病，因為病?？赡芡ㄟ^奶源將結核傳染給人。研究表明，動物體內NRAMP1（天然抗性相關巨噬蛋白）基因的表達量若提高，可以增強抗結核的能力。西北農林科技大學張涌院士團隊，利用CRISPR-Cas9技術，將牛一個拷貝的NRAMP1基因定點“放置”在DNA序列中的一個相對安全的位置上 （這種位置在基因組中俗稱為“安全港”） ，疊加牛體內原有的NRAMP1基因后， 基因編輯牛表現出更強的抗結核感染能力[6]。 在比利時藍牛群體中，有部分個體身上（特別是臀部）的肌肉一塊塊突出，被稱為“雙肌臀”[7]；科學家們研究發現，比利時藍牛的這種表型是由于MSTN（肌肉生長抑制素）基因的自然缺失突變所造成的。在羊、狗等動物中也存在因該基因自然突變導致的“雙肌”現象，但在豬中暫未發現類似的自然突變。多個科研團隊利用CRISPR-Cas9技術，精準模擬了MSTN的自然缺失突變，使編輯豬也獲得了“雙肌”表型[8-10]。豬肉是全球餐桌上重要的肉類來源之一，近些年全球每年的生豬出欄量都超過了10億頭。另外有意思的是，與小型哺乳動物相比，豬在遺傳、體型大小、解剖特點、生理代謝和疾病特征上都與人更為相似，因此被公認為是一種理想的疾病模型動物。亨廷頓舞蹈癥是一種罕見病，患者表現出不停地“手舞足蹈”等病癥，病情會逐步惡化直至死亡。研究表明，該病是由于一個名為Htt基因中CAG的序列重復次數異常增加所造成的，該突變造成患者腦部的一種神經元選擇性死亡，從而產生“舞蹈癥”。中科院賴良學研究員課題組和美國華人李曉江教授團隊合作，利用CRISPR-Cas9技術，用患者的CAG重復序列替換掉豬相應位置的序列，獲得的基因編輯豬也表現出“舞蹈癥”及典型的腦部特定神經元選擇性死亡[11]。而腦部特定神經元選擇性死亡這一典型病理特點， 是過去在小鼠等動物模型長期研究中都無法獲得的。 該研究成果一經報導，在國際上引起了轟動。上述幾個例子中，都是先在實驗室培養的細胞中，利用基因組編輯技術“修改”序列，然后針對編輯好的細胞開展克隆工作以獲得基因編輯個體。這幾個例子生動地說明，基因組編輯技術在農業動物品種改良中可以發揮出“立竿見影”的效果。通過該技術創制的精準動物疾病模型，可以很好地服務于人類健康醫學和藥物研發。

3 堿基編輯器及其在動物研究領域的應用

CRISPR-Cas9 技術因其出彩的表現而倍受科研人員的喜愛，然而，該技術在實施精準修飾時要將DNA 雙鏈都打斷，這引發了一些人對基因組穩定性是否會受到威脅的疑慮；另外，在精準修飾時一定要添加修復“模板”，即使是只“修改”DNA 序列中的一個堿基，“模板”在發揮作用時也可能“不聽使喚”。該技術是否有進一步升級的空間呢？美國基因組編輯技術大咖之一——哈佛大學的 David Liu（劉如謙）教授的團隊實現了新突破。他們分別利用胞嘧啶脫氨基酶和腺嘌呤脫氨基酶，與人為突變后的CRISPR-dCas9（Cas9 蛋白喪失切割功能）或 CRISPR-nCas9（Cas9 蛋白只切割 DNA 的一條鏈）系統相結合，使 DNA 序列中的 C 轉變成 T[12]、 A 轉變成 G[13]。 堿基編輯器有如“一支帶橡皮擦的鉛筆”，將目標位置上 C/A堿基的組成元件修改后即變成了 T/G 堿基；該過程無需切割 DNA雙鏈，也不需要修復“模板”的參與，且 效率非常高。這 種利器可以精準地改變DNA序列中某個特定堿基，且 不導入任何的外來序列，從這點來說是非常安全的。要知道，在每個人的人生長河中，都可能自然產生成千上萬個以上的突變。此外，通過堿基編輯器，可以在一個基因中將 CAG 中的 C 改變成 T，由于 TAG 屬于基因的終止密碼子，這樣的改變使得基因的表達提前被終止了，這等同于基因敲除，但又不會導致雙鏈 DNA的斷裂。

堿基編輯技術問世以來被寄予了厚望，因為一半以上人類疾病的發生都是由于單個堿基突變所造成的，堿基編輯器為這些疾病的治療提供了無限想像的空間。農業動物領域的很多重要經濟性狀也是由單個堿基的變化來調控的，利用堿基編輯器改良品種性狀或研制人類疾病模型，具有巨大的應用潛力。例如，SOCS2基因與生長發育顯著相關，科研人員利用堿基編輯技術，將綿羊該基因中的一個重要位點由C“修改”成 T 后，基因編輯羊生長速度明顯高于未經編輯的羊[14]。針對兔的MSTN基因，科研人員通過堿基編輯器，將一個 C“修改”成 T 后，提前產生了終止密碼子，與上述通過 CRISPR-Cas9 技術獲得的基因敲除豬相似，基 因編輯兔也表現出“雙肌”表型，但 后者僅僅是“修改”了一個堿基，沒 有切斷DNA雙鏈[15]。 中國農業大學吳森老師課題組，利用堿基編輯器，將豬TWIST2中的一個 C 轉變成 T 后，基因編輯豬表現出眼瞼缺損-巨口綜合征，精準地模擬了該基因突變在人中所產生的表型[16]。另外，堿基編輯器還有一個明顯的優勢，那就是由于其編輯的高效性，該技術可以較輕松地同時編輯多個位點。

4 結 語

CRISPR-Cas9 技術問世至今不到十年的時間，而堿基編輯器的發展歷程就更短；即使在這么短的時間內，這兩種技術體系已表現出勢不可擋的發展態勢。誠然，任何一種新鮮事物，其在誕生的初期都會或多或少存在一些問題，對于 CRISPR-Cas9 和堿基編輯技術，目前表現最為突出的問題就是可能存在脫靶的情況。不過我們堅信，隨著科研人員在基因組編輯領域的不斷深入探索，將不斷會有更安全、更高效的基因組編輯工具出現，為整個人類社會提供更出彩的服務。